报告为标准，将样本立即放置入液氮罐中保存，转入-80℃冰箱长期保存，在实验前取出，提取乳腺癌组织的MicroRNA，同时进行病理学的监测，对乳腺癌组织的病理学进行分型，肿瘤的浸润程度按照国际抗癌联盟标准分类，淋巴分化以及转移采用国际WHO的诊断标准进行分析判断，对所有手术治疗的患者从出院到死亡进行随访观察，以1年内每3个月1次、2年内每半年1次进行随防，终生随访。
1.2 实验试剂和仪器
1.2.1 试剂 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG（美国Invitroge公司），TaqMix（东盛生物公司），PCR试剂盒、TaqMan miRNA试剂盒（美国Santa Cruz公司），RNA提取试剂盒采用（美国Sigma），DEPC（上海碧云天生物），乙醇、异丙醇、氯仿（上海硕盟生物）。
1.2.2 仪器 倒置相差显微镜（日本奥林巴斯），高速冷冻离心机（德国Biofuge Stratos），-80℃、-4℃冰箱（日本松下），高压消毒箱（美国Tuttnauer），转膜仪及电泳仪（美国伯乐公司），PCR仪（澳大利亚Rotor-gene），紫外分光光度仪（Beckman Coulter 公司）。
1.3 RNA提取及RT-PCR反应
对乳腺癌组织采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，采用TaqMan MicroRNA试剂盒检测MicroRNA-421在患者乳腺癌组织中的表达情况。内参校正：RT-PCR反应每个样本量取10 ng的RNA提取量，由于实验测试过程中受到RNA逆转录效率、RNA浓度定量误差以及每个样品等体积的cDNA的含量不同等系统误差的影响，我们采用RNU6作为实验内参。对MicroRNA-421的表达水平采用二步法进行检测，第一步是通过茎环引物来合成互补cDNA，再通过MicroRNA的逆转录系统对10 ng RNA进行逆转了反应体系进行反应，在PCR管加入10 μL的逆转录缓冲液，总的RNA浓度调整到2 ng/μL，最后加入5 μL的逆转录引物，在冰上混匀之后反应5 min，接着进行梯度变性反应，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min递减，第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反应体系，反应体系为2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman miRNA的特异性引物，通过逆转录体系进行反应，cDNA共5 μL加入到RNA的去酶的水当中，将体积扩增至20 μL，通过循环反应94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min递减的扩张40个循环之后，对实验结果进行分析，采用实时定量反应，按照PCR操作说明，Ct的检测值应当在20～32之外的需要进行第二次检测。应用ΔCt=CtMicroRNA-421-CtRNU6的计算公式计算MicroRNA-421的相对表达量。
1.4 统计学方法
应用SPSS 21.0统计学软件全部数据建立数据文件，将MicroRNA-421表达水平分为两组，小于平均值为低表达组，大于平均值作为高表达组。通过分析MicroRNA-421的表达水平高低与发病相关因素分析以逐步回归法筛选有统计学意义的变量，对临床病理因素之间的风险情况采用Logistic回归分析，计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用t检验或方差分析，组间率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MicroRNA-421的相对表达量与临床病理特征之间的相关性
乳腺癌组织的MicroRNA-421的相对表达量为0.436（95%CI 0.323～0.534），表达量低于平均值42例，高于平均值54例，MicroRNA-421相对表达量与患者的年龄、性别、分化程度、瘤组织大小并不存在相关性（P>0.05）；而在远处转移方面，远处转移组的MicroRNA-421相对表达量明显下调（P<0.05），而无远处转移组的相对表达量与正常组相比差异无统计学意义（P>0.05），MicroRNA-421相对表达量明显下调与远处转移的风险有关，见表1。
2.2 MicroRNA-421相对表达量的高低与临床病理因素之间的关系
采用Logistic回归分析方法分析MicroRNA-421相对表达量的高低与临床病理因素之间的相关性，MicroRNA-421相对表达量的高低增加了远处转移的风险（OR=5.16，95%CI为1.27～20.83，P=0.03），见表2。
2.3 MicroRNA-421的相对表达量与预后之间的相关性
96例乳腺癌组织的MicroRNA-421的相对表达量为0.436，95%CI为（0.323～0.534）表达量低于平均值42例，高于平均值54例，MicroRNA-421相对表达量明显下调的患者中生存时间为（37.34±10.90）个月，而MicroRNA-421高表达的患者生存时间为（54.23±12.43）个月，两组比较差异具有统计学意义（t=2.398，P=0.026），MicroRNA-421表达的高低与预后有着一定的相关性，见封三图5。
3 讨论
乳腺癌是女性高发恶性肿瘤，中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国主要城市10年来乳腺癌发病率增长了37%，死亡率增长了38.9%。2011年美国CA杂志（A Cancer Journal for Clinicians杂志，2010年影响因子94.262）公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230 480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，大部分乳腺癌患者初次入院检查已经是中晚期，因此探求研究乳腺癌发病的机制具有重要的现实意义[6-10]。通过大量的临床研究发现，MicroRNA是一类能够调节多种靶基因发挥生物学效应的重要分子，也是目前肿瘤分子机制的研究热点内容[11-13]。最近研究发现MicroRNA作为新型的非编码的单链RNA在乳腺癌标志的研究当中取得了一定的进展，已有研究发现，乳腺癌异性的MicroRNA表达谱可用于肿瘤的诊断和分型当中，差异性表达的MicroRNA对乳腺癌的亚型、转移以及病理改变具有重要的意义，尤其是在术后复发率及生存期应用中可起到预后评估的作用。研究还提示MicroRNA相对表达量与乳腺癌的发展及预后有着重要关系，组织分型结果可见，其中MicroRNA-125b、MicroRNA-56a、MicroRNA-33的高表达对于乳腺癌的远处转移有着重要的价值。MicroRNA涉及到各类肿瘤的发生发展，且MicroRNA的表达谱还决定着肿瘤基因表达，在肿瘤亚型、转移等临床病理因素中发挥着重要作用，尤其对于术后的生存期及预后具有一定的相关性，研究提示了MicroRNA可以用于对肿瘤预后的评估，其表达量与肿瘤的预后有着一定的相关性[14，15]。
MicroRNA所具有的肿瘤调控作用是通过与其靶向的MicroRNA的MicroRNA-3’UTR结合活编码区的子序列碱基配对相关，主要通过负调控MicroRNA对整个相关基因表达体系发挥着精细调节的作用[19]。通过负调控靶基因，而促进靶基因的抑制作用，进而促进了肿瘤的发生发展，而抑制过表达的MicroRNA，可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移侵袭能力。我们通过高通量筛选技术筛查出了与乳腺癌相关的Micro- RNA-421，该分子是MicroRNA-200家族中的重要成员，其编码定位在人的1号染色体（1p34.23）上，多种肿瘤都出现该区域，以往研究发现MicroRNA-421在不同肿瘤组织中均有差异性表达，其调控功能也有所不同[16，17]。有文献报道MicroRNA-421的下调在结肠癌、乳腺癌、宫颈癌等中具有预后判断价值。研究还发现在膀胱癌中MicroRNA-421表达的下调可作为膀胱癌晚期的标志性分子[18]，过表达的MicroRNA-421可以子宫内膜癌的发生，还可提高顺铂对子宫内膜癌的细胞毒作用，提示MicroRNA-421在肿瘤的调控中具有重要的作用。本研究主要探讨MicroRNA-421在乳腺癌中发生和转移中的作用，结果显示MicroRNA-421相对表达量与患者的年龄、性别、分化程度及瘤组织大小等并不存在相关性（P>0.05）；而在远处转移方面，远处转移组的MicroRNA-421相对表达量明显下调，而无远处转移组的相对表达量与正常组相比差异无统计学意义（P>0.05），MicroRNA-421相对表达量明显下调与远处转移的风险有关；在生存分析方面，42例MicroRNA-421相对表达量明显下调的患者中位生存时间为（37.34±10.90）个月，而MicroRNA-421高表达的患者生存时间为（54.23±12.43）个月，MicroRNA-421表达的高低与预后有着一定的相关性。
综上所述，我们发现MicroRNA-421在乳腺癌中表达下调，与组织分化及预后有着密切的相关性，提示MicroRNA-421可能与乳腺癌的转移侵袭等影响预后的因素有关，该分子差异性表达推测其可能是乳腺癌早期的潜在靶点，但是本研究不足的是病例数还相对较少，MicroRNA-421在乳腺癌中的作用机制及靶基因生物学预测和阐明有待于进一步研究。
[参考文献]
[1] Brandl A，Wittmann J，J？覿ck HM. A facile method to increase titers of MicroRNA-encoding retroviruses by inhibition of the RNaseIII enzyme Drosha[J]. Eur J Immunol，2012， 41（2）：549-551.
[2] Min H，Yoon S. Got target Computational methods for microRNA target prediction and their extension[J]. Exp Mol Med，2013，42（4）：233-244.
[3] Maere S，Heymans K，Kuiper M. BiNGO：A Cytoscape plugin to assess overrepresentation of gene ontology categories in biological networks[J]. Bioinformatics，2014，21（16）：3448-3449.
[4] Sethupathy P，Megraw M，Hatzigeorgiou AG. A guide through present computational approaches for the identification of mammalian microRNA targets[J]. Nat Methods，2011，3（11）：881-886.
[5] Fassi Fehri L，Koch M，Belogolova E，et al. Helicobacter pylori induces miR-155 in T cells in a cAMP-Foxp3-dependent manner[J]. PLoS One，2010，5（3）：e9500.
[6] Valeri N，Gasparini P，Fabbri M，et al. Modulation of mismatch repair and genomic stability by miR-155[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，107（15）：6982-6987.
[7] Du Y，Xu Y，Ding L，et al. Down-regulation of miR-141 in gastric cancer and its involvement in cell growth[J]. J Gastroenterol，2009，44（6）：556-561.
[8] Ueda T，Volinia S，Okumura H，et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer：A microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol，2013，11（2）：136-146.
[9] Wu CX，Zheng Y，Bao PP. Pattern of changing incidence of gastric cancer and its time trend in Shanghai[J]. J Sur Concepts Prat，2012，13（1）：24-29.
[10] Lee JW，Park YA，Choi JJ，et al. The expression of the miRNA-200 family in endometrial endometrioid carcinoma[J]. Gynecol Oncol，2014，120（1）：56-62.
[11] Bockmeyer CL，Christgen M，Müller M，et al. MicroRNA profiles of healthy basal and luminal mammary epithelial cells are distinct and reflected in different breast cancer subtypes[J]. Breast Cancer Res Treat，2011，130（3）：735-745.
[12] Sun T，Wang C，Xing J，et al. MiR-429 modulates the expression of c-myc in human gastric carcinoma cells[J]. Eur J Cancer，2012，47（17）：2552-2559.
[13] Mees ST，Mardin WA，Wendel C，et al. EP300-a miRNA-regulated metastasis suppressor gene in ductal adenocarcinomas of the pancreas[J]. Int J Cancer，2010，126（1）：114-124.
[14] Baek D，Villén J，Shin C，et al. The impact of microRNAs on protein output[J]. Nature，2013，455（7209）：64-71.
[15] Ouyang G，Wang Z，Fang X，et al. Molecular signaling of the epithelial to mesenchymal transition in generating and maintaining cancer stem cells[J]. Cell Mol Life Sci，2010，67（15）：2605-2618.
[16] Manning G，Whyte DB，Martinez R，et al. The protein kinase complement of the human genome[J]. Science，2012， 298（5600）：1912-1934.
[17] Krishnamachary B，Zagzag D，Nagasawa H，et al. Hypoxia-inducible factor-1-dependent repression of E-cadherin in von Hippel-Lin-dau tumor suppressor-null renal cell carcinoma mediated by TCF3，ZFHX1A，and ZFHX1B[J].Cancer Res，2011，66（5）：2725-2731.
[18] Krek A，Grun D，Poy MN，et al. Combinatorial microRNA target predictions[J]. Nat Genet，2005，37（5）：495-500.
[19] Ohashi S，Natsuizaka M，Naganuma S，et al. A NOTCH3-mediated squamous cell differentiation program limits expansion of EMT-competent cells that express the ZEB transcription factors[J]. Cancer Res，2013，71（21）：6836-6847.
（收稿日期：2015-09-02）
