[摘要] 目的 检测小鼠原位肝癌模型中Th17细胞的表达，探讨其在肝癌免疫中的作用。 方法 30只Balb/C小鼠随机分为肝癌模型组（10只）、生理盐水对照组（10只）、空白对照组（10只），流式细胞术检测小鼠分离纯化后的各组新鲜脾脏Th17细胞的相对比例；实时RT-PCR检测各组肝组织IL-17基因和RORγT基因表达水平。 结果 肝癌模型组脾脏Th17/ CD4+T细胞的比例高于生理盐水对照组脾脏、空白对照组脾脏，差异有统计学意义（P < 0.01），而各对照组之间的比例差异无统计学意义（P > 0.05）。肝癌模型组肿瘤组织IL-17 mRNA和RORγT mRNA的表达水平均高于各自对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），而IL-17 mRNA和RORγT mRNA在各自对照组之间表达水平的差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 Th17细胞在小鼠原位肝癌模型中数量增多，IL-17表达升高，增强免疫反应，但在肝癌免疫中的作用及机制复杂，有待深入研究。
[关键词] 肝癌模型；Th17细胞；IL-17；RORγT
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）35-0005-03
肝细胞癌（hepatocellutar carcinoma，HCC）是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，死亡率列前三位[1]，我国是HCC多发国家。但目前以手术为主的综合治疗方法疗效仍不理想，故近年来免疫治疗越来越受到重视。
Th17细胞是一种以分泌IL-17为主要特征的CD4+T细胞，孤核受体RORγT是其特异的转录因子。Th17细胞首先是在EAE和CIA的研究中被发现，现研究表明IL-17的表达和人类很多自身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病等[2-4]。最近研究发现，在一些肿瘤患者或小鼠肿瘤模型的肿瘤标本中Th17细胞明显升高，但是关于Thl7和HCC的研究，国内鲜有见到相关的报道。故本研究通过建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，检测脾脏中Th17细胞的比例、肿瘤微环境中IL-17基因和RORγT基因的表达，为能进一步系统地研究Th17细胞在肝癌免疫中的作用和机制打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1动物：6～8周龄SPF级雄性Balb/C小鼠，体重（20±2）g。30只小鼠随机分为肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组，各10只进行实验。
1.1.2肿瘤细胞株 鼠源性H22腹水型肝癌细胞株。
1.1.3抗体和试剂 FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse IL-17A购自美国BD公司；SYBR Green Supermix 购自美国Bio-rad，PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。
1.2方法
1.2.1 小鼠原位肝癌模型的建立 H22肝癌细胞注入Balb/C小鼠腹腔，后抽取癌性腹水调整细胞浓度备用。肝癌模型组：小鼠麻醉后，开腹直视下将0.01 mL癌细胞悬液注入肝脏。生理盐水对照组：肝内注入0.01 mL生理盐水。模型制作后第30天处死小鼠取肝脏肿瘤组织固定，常规HE染色， 进行病理组织学诊断。
1.2.2 Th17细胞流式检测 ①取肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组脾脏，机械法分离细胞，红细胞裂解液去除红细胞。②获得的各组脾脏单个核细胞按照免疫磁珠操作规程分选CD4+T细胞。③CD4+T细胞接种于24孔培养板，加入PMA，Ionomycin，Monensin，使其终浓度分别为125 ng/mL，1 μg/mL 和1。6 μg/mL，在37℃、5%二氧化碳的环境下培养4h。④取细胞悬液，先后加入CD3-PE-CY5，FITC Rat anti-mouse CD4标记细胞表面抗原，PE Rat Anti-Mouse IL-17A胞内染色，设同型对照组。用FACS Calibur流式细胞仪检测，以CD4，IL-17A双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比记录结果。
1.2.3 实时荧光定量PCR检测 Trizol法提取各组总RNA，反转录合成cDNA。由SYBR Green Supermix，forward primer，reverse primer，cDNA等试剂建立一个10 μL 的反应体系（引物设计见表1），放入ABI高通量荧光定量PCR仪7900HT进行反应，反应条件：开始50℃ 2 min ，95°C 10 min，接着95°C 15 s 和 60°C 1 min共45个循环。最后根据待测基因和内参的循环数CT值，使用2 -△△CT方法进行相对定量结果分析。
1.3统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较均采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1小鼠原位肝癌模型建立
病理检查示肝癌组织正常肝小叶结构消失，瘤细胞异型性明显，大小、形态不一，核大、深染，肿瘤细胞排列紧密， 与周围的肝组织分界较为明显，肿瘤组织坏死明显（图1）。
2.2流式检测Th17细胞的相对比例
肝癌模型组脾脏Th17细胞占CD4+T细胞的比例（1.79±0.45）%高于空白对照组脾脏（0.17±0.17）%和生理盐水对照组脾脏（0.20±0.09）%，差异有统计学意义（P < 0.01），而空白对照组脾脏、生理盐水对照组脾脏之间Th17细胞占CD4+T细胞的比例差异无统计学意义（P > 0.05），见表2和图2。
2.3 IL-17基因和RORγT基因表达检测结果
2.3.1 肝癌模型组肿瘤组织IL-17mRNA的表达 其水平（3.70±0.43）高于空白对照组肝脏组织（0.79±0.13），生理盐水对照组肝脏组织（0.84±0.39）和肝癌模型组癌旁远端组织（0.70±0.27），差异有统计学意义（P < 0.01），而各对照组之间IL-17mRNA的表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）（表3）。
2.3.2 肝癌模型组肿瘤组织RORγTmRNA的表达水平 其水平（14.63±4.28）高于空白对照组肝脏组织（7.63±0.64），生理盐水对照组肝脏组织（7.86±1.77）和肝癌模型组癌旁远端组织（9.92±2.74），差异有统计学意义（P < 0.01），而各对照组之间RORγTmRNA的表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）（表3）。
表1 IL-17基因和 RORγT基因引物设计
注：F：上游引物，R：下游引物
表2 各组脾脏Th17细胞占CD4+T细胞的相对比例（x±s）
注：肝癌模型组与各对照组（标记*）比较，F=43.570，P < 0.01
表3 肿瘤组织及各组肝脏组织中IL-17mRNA及RORγTmRNA的表达（x±s）
注：肝癌模型组与各自相应的对照组（标记*）比较，aF = 200.110 ，aP < 0.01； bF = 14.369 ，bP < 0.01
3 讨论
肝癌患者的细胞免疫功能受到抑制，机体的细胞免疫机制可以控制肝癌的发生和发展， CD8+细胞毒性T淋巴细胞有直接杀伤肝癌细胞的作用，CD4+T细胞则是调控CTL功能的重要细胞。Th17细胞是一种分化途径不同于Thl和 Th2型细胞的CD4+T细胞。
目前关于Th17细胞在肿瘤免疫中的作用知道的还较少，其在不同肿瘤环境的作用不尽相同。如卵巢癌患者和正常人外周血中Th17细胞比例的差异无统计学意义，但在肿瘤浸润淋巴细胞中，Th17细胞的比率显著上升[5]；Zou[6]研究发现在B16黑素瘤晚期表达水平明显增高，且在外周血、骨髓、脾脏及癌组织中均升高。关于Th17细胞和肝癌的关系，曾有一项研究报道，Th17细胞水平增高与肿瘤大小、门脉癌栓、远处转移、TNM分期有明显关系[7]。
本实验主要研究肝癌环境中的Th17细胞。首先研究了肝癌模型中脾脏Th17细胞的表达，和各对照组相比，表达明显升高，有统计学差异。但HCC转移的生物学行为和不良预后很大程度上可能被局部的炎症状态所决定或影响[8]，所以对肿瘤微环境中Th17细胞进行检测很重要。结果显示IL-17mRNA和RORγTmRNA的表达水平，和各对照组相比，均明显升高，有统计学差异。IL-17作为Th17细胞分泌的最特征性细胞因子，RORγT是控制Th17细胞分化的关键性转录因子，肿瘤组织中IL-17mRNA和RORγTmRNA表达水平的升高从基因水平证实Th17细胞在肿瘤组织中是升高的。实验结果提示Th17细胞在HCC肿瘤微环境和外周免疫器官的变化存在一致性。
国外最近相似的研究结果显示，Th17细胞在肿瘤组织内的表达显著高于癌旁正常组织，是HCC预后差的独立危险因素，而且瘤内的Th17细胞与肿瘤的微血管密度呈正相关，提示Th17细胞通过培养血管生成促进肿瘤进展[9]。HCC是一种典型的慢性炎症背景上发生的恶性肿瘤，以前研究表明，STAT3信号通道及IL-23等重要细胞因子与癌症相关性炎症有关，而Th17细胞与它们关系密切，有可能成为癌症治疗的新靶点[10]。
以上报道提示Th17细胞促进肿瘤进展，但也有抗肿瘤作用的相关报道。在肝癌患者的肿瘤组织内CCL20显著增多，Th17细胞表达CCR6，二者可特异性结合诱导Th17细胞迁移，而肿瘤微环境中的TNF-α、IL-17A等又可促进CCL20的分泌，并通过CCL20/CCR6依赖的方式来募集Th17细胞[11]。 Th17细胞可以通过CCR6/CCL20途径调节树突状细胞募集来间接发挥抗肿瘤免疫效应[12]。由此可以推测肝癌中Th17细胞可通过CCR6/CCL20途径间接发挥抗肿瘤免疫效应，而且提示Th17细胞的分化和迁移与肿瘤的发生与发展有关，并通过肿瘤微环境中的细胞因子联系起来。
Thl7细胞分泌IL-17，IL-22等多种细胞因子。IL-17主要由Th17细胞产生，通常所说的IL-l7就是指IL-17A。IL-17作为一类重要的炎性细胞因子，可以与多种细胞表面的IL-17受体结合并激活它们，进而释放多种细胞因子、趋化因子以及炎性介质，并促进细胞表面粘附分子的表达，因此具有增强免疫反应的作用，这是比较确切的。但相关文献报道肝癌患者瘤内IL-17的表达升高和HCC患者的不良预后显著相关[13]，还有研究表明肝肿瘤切除后残余肝组织中存在的产生IL-17的T细胞可能加重局部肝损伤[14]，提示IL-17在肝癌中发挥着重要作用。国外有项研究发现，IL-17在体外能增强肝癌细胞的侵袭能力，在体内可明显促进肝癌荷瘤小鼠肿瘤局部血管形成和对中性粒细胞的招募，从而起到促进肿瘤生长的目的[15]。但近段时间又发现IL-17可以通过促进肿瘤组织中树突状细胞的产生，促进肿瘤特异性CD8+T细胞活性来参与抗肿瘤免疫。所以IL-17在肝癌抗肿瘤活性的机制很大程度上还是未知的。
综上所述，Th17细胞在小鼠肝癌模型中数量增多，IL-17表达升高，增强免疫反应。但同时可以看出Th17细胞具有多效性，在肝癌中的作用复杂，IL-17在肝癌中的作用及机制等仍不明确。我们希望通过后续实验的深入研究，能为肝癌的免疫治疗提供新的思路。
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（收稿日期：2013-10-09）
