【摘要】 目的 借助鼠模型观察恩度应用后肿瘤从开始生长到长到一定规模时肿瘤组织的生长情况。方法 建立肝癌H22小鼠模型，共32只小鼠，随机分为四组。在不同时间分别对各组给药，分析实验第10、14、18天四组小鼠肿瘤体积情况。结果 实验第10天、第14天所有给药组肿瘤体积与对照组肿瘤体积比较，差异无统计学意义。实验第18天：接种肿瘤当天开始腹腔给药组（B组）肿瘤体积与对照组（D组）肿瘤体积比较，差异有统计学意义（P<0.05）。接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）肿瘤体积与对照组（D组）肿瘤体积比较差异无统计学意义。结论 单独应用恩度有抗肿瘤作用，接种肿瘤时为最佳给药时机，而且需给药18d才能体现恩度抗肿瘤作用。
【关键词】 肝癌； 治疗； 恩度； 小鼠； H22肝癌细胞株
血管内皮抑素(Endostatin，ES)是胶原XⅧ在C端的一个水解片段，大小约20 kD，最初于1997年由O’Reilly等［1］在鼠成血管细胞瘤株培养液中分离提纯得到的一种内源性糖蛋白。ES通过抑制内皮细胞的增殖、迁移以及诱导凋亡等机制来抑制肿瘤血管生成已得到大量研究的证实［2］。我国学者在血管内皮抑素的结构上增加了9个氨基酸，成功解决了重组人内皮抑素复性难和稳定性差的问题，成为我国第一个上市的血管生成抑制剂类抗肿瘤药物(恩度)，在针对非小细胞肺癌(NSCLC)的联合化疗临床试验中显示出良好的疗效［3］，但对其他恶性肿瘤治疗的效果鲜有报道。从基础研究资料看，恩度的作用都指向抗血管生成，但作用于生成过程中的哪一个环节也未见报道，所以借助于鼠模型观察恩度应用后肿瘤从开始生长到长到一定规模时肿瘤组织的生长情况，则能为下一步确定恩度的作用机制建立研究平台。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病源 肝癌H22瘤株，由中国药品制品鉴定所引进。
1.1.2 实验动物 4~5周昆明小鼠，雄性32只，平均体重19~22g/只，由山西省中医研究所动物室提供。
1.1.3 实验环境 动物室室温22℃~24℃，相对湿度40%~45%，日光灯12h人工照明，专用鼠粮自由进食，洁净水自由饮用，动物实验室为清洁级。
1.2 实验方法
1.2.1 肝癌H22小鼠模型的建立 将冷冻保存在-80℃冰箱中的H22肝癌细胞复苏后，注射入昆明小鼠左腋下，7日后，肿瘤生成明显。在无菌条件下取肿瘤，以培养液调整其中瘤细胞密度至1×107个细胞/ml，用注射器吸取肿瘤悬液0.2ml注入32只4~5周龄的雄性昆明小鼠右腋下的皮下，并将32只小鼠随机分为A、B、C、D四组，每组8只，建立动物模型。
1.2.2 实验分组 将32只小鼠按随机分组方法，分成4组（A组、B组、C组、D组），每组8只。
1.2.3 各组用药方法 A组开始给药时间为实验第1天。实验第5天所有小鼠接种肿瘤。给药方法：恩度3mg/kg注入腹腔，每日1次，直至小鼠被宰杀或小鼠死亡。A组：于实验第1天（接种肿瘤日前4d）开始给药。B组：于实验第5天（接种肿瘤日）开始给药。C组：于实验第9天（接种肿瘤日后第4天）开始给药。D组：对照组，只造模。
1.3 小鼠肿瘤指标测定 将接种后的昆明小鼠在清洁级动物室内饲养，每天观察接种肿瘤生长情况。观察实验第10、14、18天各组小鼠的肿瘤体积。
1.3.1 小鼠体重 每日测量各小鼠体重，使用电子天平测定。
1.3.2 肿瘤大小 每日测量各小鼠左腋下肿瘤大小（使用游标卡尺测定），计算肿瘤体积。肿瘤体积=长径×横径2/2。
1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0专用统计软件对数据进行统计分析。使用单因素方差分析对实验数据结果进行方差齐性检验和统计分析，进一步采用LSD-t检验对数据进行多组间的两两比较分析与推断。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验第10天、第14天所有给药组肿瘤体积与对照组肿瘤体积比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）肿瘤体积与对照组（D组）肿瘤体积比较，有统计学差异（P＜0.05），接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）肿瘤体积与对照组（D组）肿瘤体积差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
肿瘤的发生、发展和转移与血管的生成关系密切。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段［4］，当其直径达到1~2mm后，若无新生血管生成以提供营养，就不能继续生长。肿瘤血管形成机制又是极其复杂的，从某种意义上来讲，是机体对肿瘤本身的血管形成机制和抑制血管形成机制的失衡造成的。
分子水平上，血管生成受两大类因子调控，分别为促血管生成因子和血管生成抑制因子［5］。血管形成抑制因子有多种，目前对血管内皮抑素的研究较为透澈，它是ⅩⅧ型胶原的一个片段，可与多种细胞表面蛋白作用，调节细胞的粘附和迁移。肿瘤停滞因子是Ⅳ型胶原的一个28000的片段，通过作用于整合素αVβ3达到抑制血管生成的作用。TSP-1是第一个被发现的内源性血管生成抑制因子，储存于血小板的α颗粒，其作用受体为CD36［6］。IL-12可以通过下调VEGF及FGF的表达抑制荷瘤免疫缺陷鼠的肿瘤生长［7］，此外，有证据表明提高血管内皮抑素、肿瘤停滞因子等含量可以抑制肿瘤血管［8］。迄今为止，已发现很多血管抑制因子，并且已被临床应用。
目前流行的观点是：肿瘤的血管形成是局部微循环中促血管生成因子和血管生成抑制因子之间的平衡发生偏斜的结果［9］。理论上讲，任何一种可以恢复促血管生成因子和抑制血管生成因子平衡的治疗都可引起血管的正常化。恩度是我国第一个上市的血管生成抑制剂类抗肿瘤药物，本实验研究单独应用恩度是观察其抗小鼠肝癌H22细胞株移植肿瘤的作用，并且选择接种肿瘤前、接种肿瘤当天、接种肿瘤之后3种开始给药时间，动态观察恩度应用后肿瘤生长情况，希望通过本实验研究发现恩度抗肿瘤的最佳给药时机，探索恩度与血管生成的相关性。结果表明实验第10天、第14天所有给药组肿瘤体积与对照组肿瘤体积比较差异无统计学意义；在实验第18天，接种肿瘤当天开始给药组（B组）肿瘤体积与对照组（D组）肿瘤体积差异有统计学意义（P<0.05），而接种肿瘤前开始给药组（A组）和接种肿瘤后开始给药组（C组）肿瘤体积与对照组（D组）肿瘤体积没有统计学差异。说明腹腔注射恩度有抗肿瘤作用，与之前的报道相符［1，2］；用药时机和给药时间体现恩度抗肿瘤效果。本实验提示，接种肿瘤当日开始给药且给药时间达18d能体现恩度抗肿瘤作用；而接种肿瘤前和肿瘤开始生长后给药不能体现恩度抗肿瘤效果。由此可见，恩度有可能只作用于新生血管，提前给药对肿瘤血管着床以及肿瘤血管生长均无效，肿瘤生长后给药对肿瘤血管生长也无效，其机制有待进一步研究。为进一步研究恩度的抗肿瘤血管机制可对本实验所留取肿瘤标本进行血管密度观察，比较不同时间、不同组别小鼠肿瘤血管密度之间的差别。
综上所述，接种肿瘤当天开始腹腔注射恩度组（B组）小鼠肿瘤比单纯造模组（D组）小鼠肿瘤小，接种肿瘤前、后开始给药组小鼠肿瘤体积与空白对照组小鼠肿瘤体积无统计学差异。接种肿瘤当天开始腹腔注射恩度有抗肿瘤作用，而且需给药18d，具体机制有待进一步研究。因此，随着恩度抗肿瘤机制研究的进一步深入，恩度有望成为癌症治疗的必不可少的重要药物之一。
参考文献
［1］O’Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell，1997，99(2)：277-295.
［2］Digtyar AV，Pozdnyakova NV，Feldman NB，et al.Endostatin：current concepts about its biological role and mechanisms of action.Biochemistry(Mosc)，2007，72(3)： 235-246.
［3］王金万，孙燕，刘永煜，等.重组人血管内皮抑素联合NP方案治疗晚期NSCLC随机、双盲、对照、多中心Ⅲ期临床研究.中国肺癌杂志，2005，8(4)：283-290.
［4］谢传高，王兴鹏.血管生成与胰腺癌.世界华人消化杂志，2001，9(3)：338-341.
［5］雷志敏，赵怡芳.肿瘤血管形成方式及其分子机制.国际口腔医学杂志，2006，33(6)：466-468.
［6］Djonov V，Baum O，Burri PH.Vascular remodeling by intussusceptive angiogenesis.Cell Tissue Res，2003，314（1）：107-117.
［7］王孝娃.影响肿瘤血管形成的几个因素.河南肿瘤学杂志，2005，18(4)：303-305.
［8］Holash J，Maisonpierre PC，Compton D，et al. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF.Science，1999，284（5422）：1994-1998.
［9］Kusters B，Leenders WP，Wesseling P，et al. Vascular endothelial growth factor-A(165) induces progression of melanoma brain metastases without induction of sprouting angiogenesis. Cancer Res，2002，62（2）：341-345.
（收稿日期：2011-04-06）
（本文编辑：梅宏伟）
