摘要：以粳糯型常规旱稻品种“冀旱糯3号”为受体材料，利用农杆菌转化法将bar基因和lea-1基因转入旱稻细胞，建立了适用于旱稻的高效转化体系，最终获得转基因植株，并对转基因植株进行PCR检测。结果表明：当农杆菌浓度（以D600 nm表示）为0.2时，转化效果最好。在筛选抗性愈伤时，除草剂的最佳浓度为40 mg/L，对抗性愈伤组织进行预分化能提高其分化率，对转基因植株进行分子检测，优化后的转化率提高到37.5%。
关键词：旱稻；除草剂；农杆菌；PCR；lea基因
中图分类号： Q785；S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0042-03
收稿日期：2014-11-05
基金项目：国家转基因生物新品种培育科技重大专项（编号：2011ZX08001-003）。
作者简介：刘青（1989—），女，硕士研究生，主要从事生物工程方面的研究工作。E-mail：liuqing12151118@163.com。
通信作者：魏景芳，博士，教授，主要从事植物细胞工程方面的教学与研究工作。E-mail：wjfang@126.com。近年来，全球水资源短缺已成为限制工农业及人类生活发展的一大因素，而旱作农业成为解决水资源短缺问题的关键。旱稻在粮食作物中至关重要，需水量少，抗旱性强，与水稻相比具有许多优势，是推行旱作农业最佳的粮食作物之一[1]。本研究利用农杆菌转化法将bar基因和lea-1基因转入冀旱糯3号愈伤组织中，培育出抗旱抗盐抗除草剂旱稻新品种，解决了旱稻种植时田间杂草和土壤干旱的问题，大大降低了农业生产成本，从而可以大面积种植旱稻。bar基因是目前抗除草剂基因工程研究中应用最为广泛的一个基因，也是迄今为止用得最多的一个抗除草剂选择标记基因，已成功用于小麦[2]、水稻[3]、玉米[4]、油菜[5]等作物中。lea-1基因是目前常用的一种抗旱基因，lea-1基因转录翻译出LEA蛋白的特殊结构可作为脱水保护剂，能部分替代水分子，保持细胞液处于溶解状态，稳定细胞结构，调节蛋白和分子伴侣参与植物渗透调节，在水分胁迫时稳定和保护蛋白质的结构及功能，可增强细胞对水的保持能力[6]。俞嘉宁等在2004年在小麦中克隆了1个第三组lea基因Ta-LEA3，研究发现小麦中该基因的表达与其抗旱性呈正相关[7]。Cheng等将小麦中LEA蛋白PMA1959基因转化水稻，在干旱胁迫或盐胁迫复水后，第二代植株的干鲜质量均高于对照组[8]。本试验将抗草铵膦bar基因作为选择标记基因，抗旱基因lea-1作为目的基因转入冀旱糯3号细胞中，建立成熟完善高效的旱稻转化体系，提高旱稻的转化率，并对转基因植株进行PCR检测。
1材料和方法
1.1旱稻材料
供式材料为粳糯型常规旱稻品种冀旱糯3号种子。
1.2基因
lea-1基因载体结构如图1所示。农杆菌菌株Agl-1，转化载体为pCAMBIA3301，其中含有小立碗藓胚胎晚期丰富蛋白LEA（Late embryogenesis abundant protein）基因，basta抗性基因，由中国农业科学院生物技术研究所路铁钢老师惠赠。
1.3培养基
1.3.1细菌培养基YEB：5 g/L牛肉浸膏+1 g/L酵母膏+5 g/L蛋白胨+5 g/L氯化钠，pH值7.4。AAM：AAM大量+AAM微量+MS有机+铁盐+肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白+68.5 g/L蔗糖+36 g/L葡萄糖，pH值5.2。
1.3.2愈伤组织诱导培养基/愈伤组织继代培养基N6大量+B5微量+B5有机+麦芽糖3%+肌醇+水解酪蛋白0.3 g/L+精氨酸0.174 g/L+天冬氨酸0.266 g/L+谷氨酰胺0.876 g/L+2，4-D 2 mg/L+凝胶0.58%，pH值5.8。
1.3.3农杆菌共培养培养基N6大量+B5微量+B5有机+铁盐+2，4-D+肌醇+水解酪蛋白0.3 g/L+蔗糖30 g+葡萄糖10 g+AS 20 mg/L，pH值5.2。
1.3.4恢复培养基N6大量+B5微量+B5有机+蔗糖3%+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3 g/L+脯氨酸0.5 g/L+特美汀500 mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.5抗性愈伤筛选培养基N6大量+B5微量+B5有机+蔗糖3%+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3 g/L+脯氨酸0.5 g/L+特美汀300 mg/L+草铵膦30 mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.6抗性愈伤预分化培养基N6大量+MS微量+B5有机+NAA 1 mg/L+6-BA 3 mg/L+ABA 3 mg/L+蔗糖 3%+铁盐+水解酪蛋白0.5 g/L+肌醇+特美汀300 mg/L+草铵膦30 mg/L+凝胶0.58%，pH值6.0。
1.3.7抗性愈伤分化培养基N6大量+B5微量+B5有机+6-BA 1 mg/L+NAA 1 mg/L+肌醇+铁盐+水解酪蛋白0.3 g/L+蔗糖3%+植物凝胶，pH值5.8。
1.3.8生根壮苗培养基1/2MS+蔗糖3%+NAA 0.5 mg/L+植物凝胶0.28%，pH值5.8。
1.4旱稻愈伤组织培养
在无菌条件下，用75%乙醇浸泡已脱壳种子2 min，用蒸馏水洗涤3次，30%NaClO浸泡40 min，冀旱糯3号种子较其他旱稻种子相比更易染菌，所以浸泡过程中应不断摇晃锥形瓶，浸泡后用蒸馏水洗涤3次，重复1次；用无菌滤纸吸干种子表面水分，无菌条件下接种到诱导培养基上，在28 ℃黑暗条件下诱导愈伤组织；培养7 d待少量愈伤长出后，进行切芽，切芽后接种于诱导培养基中，培养20 d后挑选致密、状态佳的愈伤组织进行继代培养。
1.5农杆菌介导法转化水稻
1.5.1农杆菌的培养将Agl-1农杆菌菌种（含有lea及bar基因）涂布于固体YEP培养基（含有50 mg/L硫酸卡那霉素和50 mg/L利福平）的培养皿中，28 ℃过夜暗培养3 d，从培养皿上刮取适量长出的农杆菌悬浮于液体AAM培养基中（内含终浓度为60 mg/L的乙酰丁香酮）以备转化之用。
1.5.2农杆菌转化为了确定转化侵染时合适的菌液浓度，需要比较不同浓度菌液对愈伤转化效率的影响，挑选生长旺盛的愈伤组织，分别放入600 nm处吸光度为0.1、0.2、0.3的AAM菌悬液中浸染，不断轻轻振摇20 min后，倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上吸干。用小勺将表面干燥的愈伤均匀撒在铺有1张无菌滤纸的共培养培养基上，25 ℃暗培养3 d后转移至恢复培养基，恢复培养基中不含筛选剂，主要作用是抑制农杆菌的生长。
1.6筛选
愈伤组织在恢复培养基中生长5 d后转入筛选培养基中，为了确定转化筛选时合适的除草剂浓度，需要比较不同浓度除草剂对水稻愈伤生长的影响，将经过转化的淡黄色、干爽且呈颗粒状的愈伤组织分别转入含20、40、60 mg/L草铵膦的培养基中，各培养基中接10板愈伤组织，28 ℃暗培养15 d后，观察记录愈伤组织的生长、褐化、死亡情况。
1.7抗性愈伤组织获得、分化、幼苗生根及移栽
将愈伤组织转接于筛选培养基筛选2轮，每轮15 d。挑选出浅色抗性愈伤组织接到预分化培养基上，28 ℃暗培养5～7 d，直到抗性愈伤组织变白。将变白的抗性愈伤组织转入分化培养基上，28 ℃下光照培养30 d左右，待其出现绿点；当绿点分化成3 cm左右的芽时，将芽转接于生根培养基，25 ℃光照培养3周左右，最后将苗移栽至大田。
1.8抗性植株的分子检测
按Edwards等的方法[9]提取待测的叶片总DNA。引物设计：遵循引物设计原则，利用DNAMAN软件设计PCR检测引物，引物序列如下：F：5′-AATTTCTTTCTTTTTGGATTA 3′，R：5′-TGCGGTGTCTTATTTACTAT 3′。PCR反应体系（20 μL）：DNA 2 μL，dNTPMix 1 μL，10×PCR buffer 2 μL，Taq酶0.2 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，补水至20 μL。PCR反应程序：96 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。
1.9数据处理
对转基因植株PCR结果进行分析，统计基因的转化情况。转化率各指标的统计参照文献[10]。绿苗分化率=分化绿苗数/感染愈伤组织数×100%；假阳性率=（绿苗数-PCR阳性植株数）/绿苗数×100%；转化率=PCR阳性植株株数/感染愈伤组织数×100%。
2结果与分析
2.1愈伤组织的诱导
本研究得出，不含脯氨酸的NB培养基比水稻常用的MS培养基效果更好，将常用碳源蔗糖改为麦芽糖更有利于诱导旱稻愈伤组织。在培养基中添加2 mg/L 2，4-D，能使愈伤生长为最适宜转化的粟粒大小，接种7 d后进行切芽，否则产生的大量根会影响愈伤组织的生长。20 d后待愈伤长至图2的状态时进行继代。
2.2农杆菌菌液浓度对转化的影响
试验结果表明，600 nm处吸光度为0.1、0.2的菌液侵染后比较容易脱菌，而吸光度为0.3的菌液侵染的愈伤组织脱菌后农杆菌会再次生长（图3）。但吸光度为0.1的菌液侵染的愈伤组织在后期筛选过程中死亡率较高，菌液浓度过低会降低转化率。故本试验采用吸光度为0.2的菌液进行侵染。
2.3筛选剂用量的选择
将转化后的愈伤组织恢复5～7 d后在不同筛选浓度的培养基中培养15 d，统计死亡率，20、40、60 mg/L草铵膦处理死亡率分别为11%、27%、60%。除草剂对愈伤组织的生长有很强的抑制作用，随着浓度的升高，抑制效果逐渐增强。当浓度为20 mg/L时，愈伤组织死亡率只有11%，褐化现象不明显（图4-A）；当浓度为40 mg/L时，愈伤组织明显褐化，死亡率也大幅提升。所以，为了能有效区分转化细胞和非转化细胞，降低转基因植株的假阳性率，本试验除草剂（草铵膦）浓度采用40 mg/L。把转化后的愈伤组织转到含40 mg/L除草剂的选择培养基上，经过15 d筛选，观察发现有小部分愈伤组织全部褐化死亡；有些愈伤组织部分褐化，表面松散，虽然没有彻底死亡，但是没有长出乳白色的抗性愈伤组织；另有一部分愈伤组织虽然母体褐化，但在生长点长出抗性愈伤组织（图4-B）。对于最佳筛选剂浓度的确定，要遵循一个原则：既要抑制非转化细胞生长，又不会对转化细胞造成太大损害。本试验采用的除草剂浓度为40 mg/L，低于这个浓度，大部分愈伤组织得不到控制，很难区分转化细胞和非转化细胞，造成大量假阳性；高于这个浓度，则转化细胞生长也容易被抑制，从而不容易分化。筛选过程为2轮，每轮15 d，由于冀旱糯3号的抗性愈伤组织在筛选过程中生长良好，优于其他旱稻品种，无需第3轮筛选。
2.4预分化对分化率的影响
将筛选出的一部分抗性愈伤组织直接接到分化培养基上，分化率为38%，而先经过预分化再转入分化培养基的分化率为56%，后者较优，并且试验发现冀旱糯3号的分化率
普遍高于鲲旱1号等其他旱稻品种。
通过观察发现，经过预分化的愈伤组织为白色胚状颗粒，且颜色鲜亮有光泽，在分化培养基上生长较快，长势较好，未经预分化的愈伤组织颜色发黄暗淡，生长较慢，容易褐化。分化20 d后观察，经过预分化的愈伤组织在分化过程中的绿点率高于未经预分化的愈伤组织，并且部分愈伤已分化出苗（图5）。可见，筛选出的抗性愈伤组织在分化之前先经过预分化处理可提高分化率。
由于预分化培养基中含有植物内源激素脱落酸（ABA）[11]，脱落酸是有关生长活性物质代谢的关键因子，可具有促进植物吸收营养和协调体内代谢的能力，故本试验在预分化培养基中加入ABA可有助于愈伤组织分化。
2.5T0代转化苗PCR反应结果
提取转化苗叶片DNA并进行PCR检测，由图6可见，3～21号泳道有条带，并且和作为阳性对照的质粒DNA片段大小一致，说明这20个样品中含有目的基因，可以确定是阳性植株。将扩增的目的片段进行测序，测序结果与NCBI比对，结果表明出自小立腕藓的lea-1基因已成功转化。
2.6数据处理结果
计算得：绿苗分化率41.2%，假阳性率9.1%，转化率37.5%。
3结论与讨论
冀旱糯3号为粳糯型旱稻新品种，其转化体系与普通旱稻（如鲲旱1号）有一定区别。本试验利用农杆菌转化法将目的基因导入旱稻中，建立了适用于冀旱糯3号的高效转化体系，确定了最适宜的愈伤诱导培养基为NB+2，4-D（不加脯氨酸），糖源改为麦芽糖，最佳菌液侵染浓度（以D600 nm表示）为0.2，筛选培养基中除草剂最佳浓度为40 mg/L，将筛选出的乳白色抗性愈伤组织经过5d预分化培养，可提高分化
效率。本试验提取转基因水稻基因组DNA并进行PCR检测，结果表明，利用优化后的转化体系可将转化率提高到375%。本研究结果证明目的基因已成功转入冀旱糯3号的细胞中，而目的基因的插入位点还需要进一步做tail-PCR研究。
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