西瓜种子细菌性果腐病消毒方法研究

材料与方法

1.1 试验材料

供试西瓜品种为早佳8424，由新疆农业科学院哈密瓜研究中心提供。细菌性果腐病病原菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）（以下简称Aac）由华中农业大学植物病理学研究室提供。

供试化学品：甲醛和过氧化氢均购自国药集团化学试剂有限公司，盐酸购自信阳市化学试剂厂，次氯酸钠购自天津市东丽新中村。杀菌剂：杀菌剂1号（ZC）购自中国农业科学院、杀菌剂2号（XJ）购自新疆农业科学院。

KBA培养基配方：蛋白胨20 g，硫酸镁1.5 g，磷酸氢二钾1.5 g，甘油10 g，琼脂粉13 g，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。KB液体培养基配方：KBA配方中不加琼脂粉。

1.2 抗利福平Aac菌株的诱变

制备含0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、30、50、75、100 μg/mL利福平（Rif）的KBA平板，从低浓度到高浓度逐次诱变抗100 μg/mL Rif的Rif-Aac菌株，在含100 μg/mL Rif的KBA平板上继代培养5代后保存备用。

1.3 Rif-Aac带菌西瓜种子的制备

将Rif-Aac菌株在KBA平板上划线培养48 h（28 ℃），挑取单菌落，接种于含100 μg/mL Rif的KB培养液中，30 ℃下200 r/min振荡培养24 h。将培养菌液在6 000 r/min下离心5 min，弃上清液后收集菌体，用0.1 mol/L的无菌PBS（pH 7.2）缓冲液重新悬浮，装入250 mL三角瓶中，调整菌悬液OD600 nm介于0.3～0.4（菌体浓度约108 CFU/mL）之间。将西瓜种子充分浸入菌悬液中，250 r/min振荡培养1 h，滤去菌液，自然风干后备用。

1.4 种子消毒方法

1.4.1 物理方法 干热处理在烘箱中进行。采用温度、时间双因素随机区组设计，温度设70、75、80 ℃ 3个水平，时间设24、48、72 h 3个水平，以接种过Aac的种子（CK1）和健康种子（CK2）为对照，共11个处理，每处理3次重复，每重复100粒种子。种子干热处理后浸种，采用平皿培养法将种子置入灭菌的滤纸上，加入无菌水保湿，置于30 ℃培养箱催芽，120 h后测定发芽率，统计发病种子数。从已催芽的种子中选取30粒播种于消毒基质中，进行穴盘育苗，观察并统计发病率。

1.4.2 化学方法 采用药剂浓度、处理时间双因素随机区组设计，分别配制1%、3%、5%的HCl和甲醛，1%、5%、10%的过氧化氢，1%、2.5%、5%的次氯酸钠；以上各药剂处理时间设10、20、30 min 3个水平。从各药剂消毒后的沙培苗中随机选取5株幼苗，加入5 mL无菌水在无菌研磨钵中研磨成匀浆，静置5 min后，吸取1 mL研磨液涂布于含100 μg/mL Rif的KBA平板上，30 ℃下培养48 h，观察记录菌落产生情况。对照及重复同“1.4.1”。

1.4.3 杀菌剂处理方法 配制4‰的XJ，处理时间分别为10、20、30 min；配制0.5%、1%的ZC，处理时间为1 h，对照及重复同“1.4.1”。

1.5 西瓜种子发芽势、胚根长及发芽率的测定

各处理采用平皿培养法随机选取50粒种子置入灭菌的滤纸上，加入无菌水保湿，放入30 ℃培养室催芽，72 h 后测定发芽势、胚根长，120 h后测定发芽率，每处理3次重复，每重复50粒种子。

1.6 数据处理与分析

利用Excel进行数据处理，采用SAS 8.0进行新复极差检验。

2 结果与分析

2.1 物理方法对西瓜种子细菌性果腐病的消毒效果

从表1可以看出，干热处理具有一定的消毒效果，但不能完全杀灭种子携带的Aac病原菌，且对种子的发芽势和发芽率有一定的影响。与对照相比，经干热处理后，随着温度的升高、作用时间的延长，各处理种子的发芽势、发芽率总体呈下降趋势，部分处理的发芽势、发芽率与对照差异显著。经干热处理后，与CK1相比，各处理的种子带菌率降低5.3～27.3个百分点，幼苗发病率降低11.1～31.1个百分点，不符合种子检疫性消毒后零发病、零检出的要求。

2.2 化学方法对西瓜种子细菌性果腐病的消毒效果

2.2.1 盐酸对种子的消毒效果 盐酸对西瓜带菌种子的消毒效果见表2。从表2可以看出，除5% HCl处理30 min外，其他处理种子的发芽势、发芽率之间无显著差异。盐酸处理后的种子胚根长均大于CK1和CK2。通过沙培观察子叶或胚根是否染病来评价消毒效果，1% HCl处理30 min、3% HCl处理20 min、3% HCl处理30 min、5% HCl处理20 min、5% HCl处理30 min的子叶及胚根均未出现病斑。抗性平板分离结果显示，仅有3% HCl处理20 min、3% HCl处理30 min、5% HCl处理20 min、5% HCl处理30 min幼苗中未分离出Aac菌。结合症状观察结果，认为1% HCl处理30 min幼苗中可能潜伏不足以致病数量的病原菌。综合消毒效果及成本，3%HCl处理20 min比较适宜应用于实际生产。

2.2.2 甲醛对种子的消毒效果 由表3可知，与CK2相比，大部分处理对种子发芽势、发芽率及胚根长影响较小。3%甲醛处理种子30 min后的沙培幼苗未出现感病症状，但抗性平板上出现Aac菌落，说明该处理消毒不彻底。5%甲醛对种子消毒20 min或30 min未出现病斑和未检出菌落，具有很好的消毒效果。考虑到5%甲醛作用30 min后抑制胚根生长，因此推荐5%甲醛处理带菌种子20 min。

2.2.3 次氯酸钠对种子的消毒效果 由表4可知，虽然次氯酸钠能促进种子胚根的生长，比CK1的胚根长增加了5.5～10.9 mm，但消毒效果差，且一定程度上影响了西瓜种子的发芽势和发芽率。因此，实际生产中次氯酸钠不适宜作为种子消毒剂来处理携带Aac的西瓜种子。

2.2.4 过氧化氢对种子的杀菌效果 由表5可以看出，过氧化氢处理对带菌种子的发芽势、发芽率及胚根长影响不大，但对种子Aac菌的消毒效果差，结果均为阳性。说明过氧化氢不适宜用来处理携带Aac的西瓜种子。

2.3 杀菌剂对西瓜种子的消毒效果

选用推广的2种杀菌剂，按照推广药剂的使用操作设计，试验结果见表6。由表6可知，0.5%和1%ZC对携带Aac的西瓜种子作用1 h均有良好的消毒效果，而XJ不能杀灭西瓜种子携带的Aac菌。此外，ZC处理的种子发芽势、发芽率与CK1差异不显著，胚根长显著高于CK2。因此，0.5%和1% ZC可在实际生产中推荐使用。

3 小结与讨论

由于西瓜细菌性果腐病是种传病害，对西瓜种子进行消毒是防治该病发生的最有效的方法之一。细菌性果腐病较耐干热高温，赵秋菊等[4]发现西瓜种子干热处理抑制BFB的能力低于药剂处理；Wall等[6]也发现干热处理对BFB的抑制效果不显著。本试验也证明了干热处理对果腐病的消毒效果较差。

王钦英等[7]和赵廷昌等[8]均发现，3% HCl处理15 min，水洗后，用600倍加瑞农稀释液浸种处理过夜对细菌性果斑病有较好的防治效果；杜艳梅等[9]发现1% HCl处理5 min对西瓜细菌性果斑病防治效果最好。试验结果表明，3% HCl和5%甲醛处理20 min对西瓜细菌性果腐病具有较好的消毒效果，而过氧化氢和次氯酸钠等化学药剂消毒效果较差；0.5%和1% ZC杀菌剂处理1 h对细菌性果腐病菌具有良好的消毒效果，对西瓜种子发芽率及发芽势无显著影响，且对种子胚根生长具有明显的促进作用，建议在生产上推广使用。

参考文献：

[1] 周广雄.西瓜细菌性果腐病的发生与防治[J].中国蔬菜，2006（1）：56.

[2] 许 勇，张兴平，宫国义，等.细菌性果腐病与瓜类作物健康种子生产及检测技术（上）[J].中国西瓜甜瓜，2003（6）：36-37.

[3] LOVIC B，HOOKINS D. Production steps to reduce seed contamination by pothogens of cucarbitita[J].Hort Technology，2003， 13（1）：50-54.

[4] 赵秋菊，寇明明，罗伏青，等.种子处理对西瓜细菌性果腐病种子带菌的影响[J].中国种业，2008（12）：56-57.

[5] 张国裕，张 帆，姜立纲，等.西葫芦细菌性果腐病种子带菌检测及消毒[J].中国蔬菜，2012（6）：64-67.

[6] WALL G C.Control of watermelon fruit blotch by seed heat-treatment[J].Phytopathology，1989，79：1191.

[7] 王钦英，李国英，任毓忠，等.种子处理对籽瓜细菌性果斑病防治效果的研究[J].北方园艺，2006（2）：21-23.

[8] 赵廷昌，孙福在，王建荣，等.药剂处理种子防治哈密瓜细菌性果斑病[J].植物保护，2003，29（4）：50-53.

[9] 杜艳梅，王 琳，李小妮，等.西瓜细菌性果斑病带菌部位检测及种子处理研究[J].广东农业科学，2011，38（19）：121-123.

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