摘 要 草鱼（Grass carp）是我国淡水养殖的四大家鱼之一，养殖范围广，经济价值高。但在草鱼养殖饲养过程中，易发生各种疾病，给草鱼养殖业带来巨大损失。其中，草鱼出血病是影响草鱼养殖的重要疾病之一，其病原为草鱼呼肠孤病毒。对于该病国内目前对其做了大量研究，化学药物难以达到治疗目的而免疫技术在该疾病的防治上取得了一定成就。基于此，首先总结了近年来关于草鱼出血病的研究，着重阐述草鱼出血病的病原生物学特征以及流行病学相关情况；而后就国内目前草鱼出血病疫苗研究情况做一介绍并提出该病防治的新展望。
关键词 草鱼出血病；草鱼呼肠孤病毒；流行病学；疫苗
中图分类号：S941.41+1 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）12--4
草鱼（Grass carp）属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，草鱼属。一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域，性活泼，游泳迅速，为典型的草食性鱼类。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一。但是在草鱼饲养过程中易发生各种疾病，其中草鱼出血病是一种最为常见的草鱼疾病，这种疾病严重应先我国草鱼养殖业的发展[1]。早在20世纪70年代我国就开始研究草鱼出血病，80年代发现草鱼出血病病源——病毒颗粒[2-3]，90年代初国际病毒分类委员会将草鱼出血病病源命名为草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）[4]。草鱼出血病病毒主要侵染草鱼的内脏组织，而化学药物难以达到治疗目的，目前仍然没有找到一种效果良好的特效药。但是，从免疫系统角度出发研究此病，能够在水产养殖疾病方面取得一些进展[5]。随着生物制剂技术的发展，免疫接种疫苗能够有效地减少疾病的发生。故探讨草鱼出血病流行病学特征以及草鱼出血病疫苗的研制情况对于草鱼出血病的预防，减少草鱼养殖业中的经济损失非常重要。
1 出血病病毒生物特性
草鱼出血病病毒（Grass Carp Haemorrhage Virus，GCHV）是水生呼肠孤病毒，隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，因此又称为草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）。病毒形态结构与正呼肠孤病毒相似，随着科技的发展和医疗技术的进步以及计算机网络、三维技术的提高，病毒研究工作也得到了有效的进展。方勤等[7]对该病毒的衣壳蛋白特性和三维重构研究，研究结果显示：GCRV颗粒排列在RNA核心与内/中/外壳层，呈现多层排列的特点。病毒的外衣壳是由200个按T=13对称排列的三聚体构构成。该病毒排列的特点是在5次轴上出现三聚体缺失凹陷区，三聚体亚单位暴露出中间层，而内壳层由T=1排列的120个病毒单体组成。
此病毒基因组为双股RNA，由11个片段组成，核酸的总分子质量为1.55×107u[8]。该病毒完整的病毒粒子在氯化铯（CsCl）一定的密度梯度离心浮力密度、蔗糖梯度离心以及沉降系数等状态下呈现出一定的形式，对热（56 ℃，1 h）稳定，而在65 ℃，1 h完全失活[9]。病毒对类脂溶解（如氯仿）不敏感，对酸（pH=3）、碱（pH=10）处理不敏感。经酸处理后，毒力增强，滴度提高，另外，此病毒毒性的提高还与草鱼体内精氨酸和胰蛋白酶量增加有关[10]。
GCRV不仅能在草鱼自身体内繁殖，而且具有遗传性，它能够在草鱼体内产生合胞体状细胞病变效应（CPE）[11]。此病毒可在GCO、GCK、CIK、ZC-7901、PSF以及GCF等草鱼细胞株内增殖。胞浆内的病毒呈晶格状排列，在温度为28 ℃时复制速度最快，一般情况下，草鱼在此温度环境下感染病毒12 h以后病毒就开始复制，24～27 h以后病毒开始大量繁殖，侵害操于体内的正常细胞，使之病化，细胞标体会出现2 mm长的空斑[12]，这种表象是草鱼细胞受感染的重要标志。
2 草鱼出血病病毒致病机理分析
病理组织学观察，可见全身毛细血管内皮细胞受损，血管壁通透性增高引起毛细血管或小血管出血以及形成血栓。由于血液循环的障碍，导致全身各脏器组织不同程度的变性坏死。血液学指标检测显示，红细胞、白细胞和血红蛋白显著低于健康鱼，血清谷丙转氨酶（SGPT）、血清乳酸脱氢酶（SLDH）及血清异柠檬酸脱氢酶（SIDH）活性增高。在某些感染鱼中，乳酸脱氢酶（SLDH）紊乱，SLDH明显多出一条区带[13]。血浆总蛋白、血清总蛋白、尿素氮、胆固醇降低。
草鱼出血病毒的危害主要是通过破坏草鱼循环系统，减弱草鱼血管凝血作用，导致操于体内血清乳酸脱氢酶相对活性的紊乱，这时草鱼的生理功能失调，最终各种疾病。此病毒能够破坏草鱼的血液系统降低草鱼的血液缓冲系统功能，草鱼体内生成大量的固定酸，这些固定酸又不能被及时代谢出去，导致草鱼肠道发生病变，减弱其肠道功能，导致草鱼体内出现酸中毒。在多种因素的共同作用下，操于体内的一些酶活性受到抑制，导致草鱼一些脏器系统法和免疫系统受到较大的影响，比如草鱼体内皮质区淋巴细胞减少、坏死等。
3 草鱼出血病临床症状
草鱼出血病是一种危害性比较大的疾病类型，此病的主要临床症状：初期草鱼会有不同程度的食欲不振、头部发黑，或者草鱼背部出现浅白色条带；随着病情的加重草鱼会出现不同部位的出血症状，出血的部位包括头部、口腔、上下颌、鳃盖以及腹部等部位，有时也可能表现为眼球突出甚至出现全身肌肉呈鲜红色、肠壁充血等症状[15]；由于鱼体严重出血，导致贫血的发生，此时鳃丝通常呈灰白色。出血严重时，病鱼因贫血而使得血液颜色变淡，血量明显不足，部分脏器颜色也变淡。
以上描述的症状主要以出血现象为主，但在实际生产中，发病鱼的症状并不是上述所有症状都会出现，每一条鱼的症状也各有不同，有时可同时出现两种，不能将它们绝对地分开，它们之间可同时混合发生。根据中国科学院水生生物研究所长期的观察结果发现，病鱼的主要症状可大致划分为以下三种类型：
红肌肉型：出现这种症状的病鱼外表没有明显的出血症状，即便有出血症状也比较轻微，一般病鱼肌肉呈点状或斑块状出血，严重时全身肌肉呈鲜红色。因失血过多，鳃丝呈灰白色，此类症状一般发生在较小的草鱼身上。
红鳍红鳃盖型：这种类型的症状一般以体表出血为主，草鱼的鳃盖、口腔、上下颌以及眼部周围能够看出有明显的充血、出血现象，此类症状一般发生在较大（13 cm以上）的鱼种中出现。
肠炎型：病鱼以肠道充血、出血为主，体表及肌肉出血不明显。严重时可见肠道呈鲜红色，肠系膜脂肪和鳔可见点状出血。这种类型一般在大小草鱼上都可见到。
4 草鱼出血病的流行病学特征
草鱼出血病之所以那么严重，除了其自毒性比较大以外，还有它具有较强的传染性，该病一旦流行，传播速度比较快，而且发病时间长，有具有较高的发病率。可造成草鱼鱼种的大量发病死亡，造成严重的损失。可使2.5～15 cm大小的草鱼发病，以7～10 cm当年草鱼种最为普遍，有时也可使2龄以上的大草鱼发病。本病发病率高，死亡率也高，可达70%～80%以上，造成大量草鱼种死亡。流行季节在6月下旬至9月底，8月为流行高峰期。一般发病水温在20～33 ℃，最适发病温度为27～30 ℃。健康草鱼感染此病毒以后，一般在4～15 d内发病死亡，该病病情进展有3个阶段，潜伏期、前趋期和发展期[15]。该病毒也可感染青鱼、麦穗鱼，其它鱼未见感染报道。
20世纪50年代初，倪达书等[16]专家就发现草鱼出血病伴有出血症状，怀疑草鱼出血病是一种病毒性疾病。而最早发现草鱼出血病是在20世纪70年代的湖北某水产养殖场，当时在湖北、两广、江浙等地区非常流行[1]。对于我国草鱼出血病的流行情况，陈艳[17]依据2001年和2002年全国草鱼出血病病情月报的数据进行分析，草鱼出血病主要流行地区为江西、安徽、广西福建天津等地区。研究结果显示草鱼出血病一年有两次死亡高峰期，这两次死亡高峰期分别是每年的7月和9月。草鱼病的流行特征在不同地域有相同的流行特点，但是也有一些不同的流行特点，这可能与不同地区自然环境不同有关。而且同地方的同一疾病，在不同流行年份流行特征也有所不同，所以，草鱼病的防治结合各个地区自然环境特点等因素进行综合考虑，总结出发病规律，以便更好开展防治工作。
5 草鱼出血病疫苗研究进展
草鱼出血病引起草鱼鱼种大规模的发病，导致鱼种大量死亡，对于养殖业所造成的损失是不可估量的。根据人类医学研究表明，病毒病一直是很难通过药物起到治疗效果，对于草鱼出血病更是无有效的药物进行治疗。因此，预防该病的发生显得尤为重要，近几年，草鱼病的防治重点一直在免疫疫苗的研究。免疫疫苗的防治主要是通过对草鱼出血病进行灭活疫苗、减毒疫苗的分析与研究，发挥其免疫效果作用。而且随着生物学的发展，疫苗免疫保护效果的研究越来越完善[18]。下面对上述几种疫苗的优缺点以及免疫保护效果作简要的评价。
5.1 灭活疫苗
灭活疫苗的主要机理是利用某种高科技方法灭活草鱼病原体的感染性蛋白[19]，如利用灭活剂或者加热处理方式在不改变草鱼原有免疫系统功能的情况下杀死草鱼活病原微生物。其优点是研制周期短，制备方便，使用安全，易于保存。其缺点是需要有大量的病毒基础才能引起免疫应答作用。而大量病毒又可能引起草鱼局部或全身的不良反应[20]；另外，该疫苗由于不能进入MHC I类抗原呈递途径，所以在实际使用过程中也很难达到消耗的效果，即便有较好的效果，但是效果比较短暂[21]。
5.2 减毒活疫苗
减毒活疫苗是通过化学或物理的方法，使得病原体的毒力单位活性减低，但又不丢失其具有免疫原性的一类疫苗，通常具有较好的免疫原。优点是该病毒的繁殖能够在宿主体内进行，这样就减少了在草鱼体内注佐剂的环节，不会影响草鱼肉的品质，而且此疫苗免疫期比较长。缺点是在使用此种免疫疫苗进行处理过程中存在一定的致病性，如果刺激性过强会有一定程度的潜在危险性；同时，这种活疫苗的生产对周围环境有一定的影响；而且这种免疫疫苗不便于储存，保质期比较短，一般情况下需要冻干保存。所以这种免疫疫苗应用成本比较高，影响其在发展中国家的推广应用。许淑英等[20]对该疫苗进行研究，研究结果显示，此类疫苗的应用能够实现100%草鱼成活率和免疫保护率。
5.3 基因工程疫苗
此类免疫疫苗主要是通过重组草鱼DNA进行的治疗，DNA重组技术应用于草鱼身上能够使草鱼产生优质抗原。在医学上大家普遍认为所谓理想的疫苗必须具备安全、稳定、低价，并且含有两种或者两种以上的保护性免疫原，而且口服一次既能产生良好的效果的疫苗。目前，研制的免疫疫苗中仍然没有一种疫苗能够完全符合以上全部条件，所以基因疫苗越来越被人们所关注。基因疫苗比传统疫苗具有较多的优点，这些优点主要表现在：一是草鱼接种基因疫苗以后，抗原蛋白在草鱼细胞内加工处理与病原的自然感染过程相似，而且他们的抗原呈递过程也比较相似，所以能够在草鱼体内诱导机体产生免疫功能；二是免疫疫苗的抗原基因能够在草鱼体内存活较长的时间，抗原蛋白能够持续提供给免疫系统刺激，刺激草鱼机体产生持久性的免疫应答；三是基因工程疫苗能够将同抗原基因的质粒混合，以便达到联合免疫作用，提高免疫效果；四是这种免疫疫苗没有免疫原性，能够反复利用，成本比较低。
总之，基因疫苗比其他形式的免疫疫苗具有较强的抗原性，保质期比较长，制作工艺简单，运输方便，成本廉价，是一种全新的草鱼病毒免疫方式，受到越来越多国家和地区渔民的青睐。但是基因工程疫苗中抗原基因的选择对疫苗的免疫效果有重要的影响。
5.3.1 重组亚单位疫苗
这种疫苗技术主要是利用重组DNA技术将抗原基因进行体外表达，使病原机体产生病源蛋白，利用病源蛋白的免疫保护性功能达到免疫应答作用。其优点是副作用少，不易致癌及回复突变，疫苗是通过直接合成。但是其制备过程复杂，成本较高，技术要求也高。方勤等对重组亚单位疫苗进行研究，研究结果显示，重组病毒不仅能够也构建表达VP6的重组病毒，而且能够获得一定的蛋白表达。这项研究为基因工程疫苗的研究与开发奠定了基础。
5.3.2 DNA疫苗
DNA疫苗是将鱼体内部注射一定量的某种蛋白质抗原重组真核表达载体，以便使草鱼体内形成活体免疫系统，起到诱导免疫细胞应答的作用。这种疫苗与传统疫苗相比具有一定的稳定性高、安全性高、免疫全面、生产规模大等特点，被人们称为继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的新一代疫苗。徐诗英等将草鱼呼肠孤病毒（GCRV）外衣壳蛋白VP7双基因（约0.9 kb）及团头鲂的β-肌动蛋白启动子（约0.56 kp）的研究。研究结果显示接种适当剂量的该疫苗能起到100%的免疫保护效果。为基因工程疫苗的进一步开发奠定了基础。
6 我国商品化疫苗研究
对于我国草鱼出血病商品化疫苗的研究，前几年，中国水产科学研究院研发的草鱼出血病活疫苗（GCHV-892 株）获得新兽药证书，标志着草鱼出血病活疫苗国内外首个研制成功，自此草鱼出血病活疫苗研究与应用得到了进一步发展。早在20世纪60年代我国就研制出了水产疫苗草鱼出血病组织浆灭活疫苗-土法疫苗后。20世纪90年代我国研制出免疫效果好、保护期长等优点的高效弱毒疫苗，该疫苗的研制是通过天然活性物质对草鱼病毒进行降毒、减毒处理。该疫苗具有较多的优点，如便于储存、使用方便等，此疫苗应用一次就能起到较好的免疫功能，此疫苗经过在两广、江浙等地区应用试验，能够达到90%的免疫保护率。
7 草鱼出血病防治研究展望
草鱼出血病是一种更严重的病毒性鱼病，对草鱼的危害性比较大，发病率和死亡率在80%以上，这种病在水温20～30 ℃时最为流行，尤其是在水质条件差，水中各种氮和有机抗氧量偏高的情况下最易流行。病毒一旦流行开开很难遏制，一般健康草鱼染病后7～15 d就会出现严重症状以及死亡，而且此病毒具有较高的传染性。目前，药物治疗没有较好的治疗效果。我国对草鱼出血病的治疗研究主要集中在免疫疫苗治疗方面，并取得了教好的治疗效果。
首先，草鱼出血病的病原主要存在鱼体活组织细胞内而形成的大量治病病毒，对于病毒的治疗如果采用化学药物疗法，药物很难侵入被病毒感染的组织细胞内部，即便能够侵入病毒组织细胞含量也不高，很难对病毒产生具有威胁力的杀伤性，疗效不高。其他药物也很到起到较好的防病毒药物，目前，对草鱼出血病只能采取一些预防性措施，或者通过免疫系统增加草鱼计提的免疫功能来达到防止病毒入侵的效果；再或者是改变草鱼的生长环境，人为制造不利于病毒繁殖的环境。其中，采用免疫法提高草鱼机体的抗免疫能力，一次达到预防病毒入侵的效果，这是目前治疗和预防草鱼出血病的主要方式。免疫疫苗能够较好的预防草鱼出血病的发生，在防治草鱼出血病病毒繁殖与复制方面具有较好的效果。
另外，还有一种预防草鱼出血病发生的有效方式——干扰素，干扰素是一种细胞调节因子，它具有较好的抗病毒、抗肿瘤功能，而且具有免疫调节功能，用于草鱼出血病的防治具有较好的治疗效果。邵健忠等对曾经专门对某种干扰素进行分析，研究结果显示此干扰素能够激活草鱼机体内的巨噬细胞，提高草鱼巨噬细胞的吞噬以及抗病毒能力。钱凯先等研究结果显示，人工诱导干扰素对草鱼出血病的防治具有较好的效果。
近代以来，不管是我国还是世界上其他国家对草鱼出血病毒的研究都从未间断，从目前的研究结果来看，免疫预防对防治草鱼病比其他治疗形式具有较好的治疗效果。这主要是因为免疫增强剂能够提高草鱼机体免疫功能，提高草鱼抗病毒和抗感染能力。而且免疫疫苗在作用时免疫增强所需要的时间比较短，持续的效果比较长，是目前提高鱼体免疫活性，增强草鱼抵抗力最为有效的方法，在草鱼出血病的预防与治疗中具有重要的应用价值。
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（责任编辑：赵中正）
