摘要：对华支睾吸虫病流行地区人粪样进行华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）虫卵的鉴定、收集及DNA的提取，然后根据华支睾吸虫基因设计两对特异性引物，以粪便中提取的虫卵DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增目的基因片段，对PCR方法的各种反应条件进行优化。结果两对引物中以上游引物（5′-TGGCCTGACTGGCTGGCCGG-3′）、下游引物（5′-CGGCACCCCACACACATACA-3′）为最适引物，用PCR方法可扩增到分子量大小为255 bp的特异性条带，测序结果经BLAST工具进行分析，与中国沈阳分离株（AF217099）和朝鲜分离株（AF217094）的同源性为100%；50 μL PCR反应体系的最优化反应条件为：dNTP 2.6 μL；10×PCR Buffer（含Mg2+）4.0 μL；上下游引物各0.5 μL；DNA模板5.5 μL；Taq DNA聚合酶0.4 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。试验成功对吉林地区人粪样中华支睾吸虫虫卵进行了鉴定，并建立了华支睾吸虫虫卵PCR检测方法，为从分子生物学角度检测华支睾吸虫病提供了理论依据。
关键词：华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）；虫卵DNA；鉴定；PCR
中图分类号：R446.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1601-03
华支睾吸虫病是广泛流行于东亚地区和中国大部分省市的食源性寄生虫病，由寄生于人体肝胆管内的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）引起，可产生严重的肝胆并发症，与胆管癌的关系也非常密切[1-6]。目前，对华支睾吸虫的研究主要集中在对其成虫或囊蚴的研究，而对虫卵的研究甚少，仅限于对虫卵的形态学研究。本试验采用聚合酶链式反应（PCR）对人粪便中的虫卵进行鉴别，从而鉴定人是否患有华支睾吸虫病，为PCR技术在华支睾吸虫病诊断中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
粪样来自吉林省白城市镇赉县流行区村民。
主要试剂及仪器：2% Triton X-100，KOH，蔗糖/KCl溶液，PCR扩增试剂，T载体，lower DNA Marker，琼脂糖，DNA凝胶回收试剂盒。Gene Amp PCR systerm 9700（AB公司），AR1140电子天平（USA），PY-120水平脱色摇床（北京鼎国生物技术发展中心），OLYMPUS CX31RTSF生物显微镜，NANODROP2000（Thermo公司），水浴锅，超净工作台，磁力搅拌器，振荡器，组织匀浆机。
1.2 方法
1.2.1 粪便的收集与筛选 每一粪样先进行初步筛选，将少量生理盐水加入粪样中，洗去微量粪液，洗下的粪液在显微镜下观察，每个粪样做3个载玻片，若发现华支睾吸虫虫卵，即为阳性；没有发现虫卵则为阴性。将阳性粪便进行收集。
1.2.2 虫卵的收集 用沉淀集卵法收集虫卵。先将每个粪样中加入1 000 mL蒸馏水充分搅拌溶解，用40目筛过滤，除去滤渣后，滤液中再加入500 mL蒸馏水进行溶解搅拌，再用260目筛子进行过滤；滤液中再加入300 mL蒸馏水进行溶解搅拌，充分沉淀后，去上清液，留取沉淀，如此过程进行，依次降低蒸馏水的用量，直到上清液澄清，最后留取沉淀量20 mL，分装到2 mL EP管中，于-20 ℃保存。
1.2.3 虫卵DNA的提取 按参考文献[7]的方法并进行了适当改进。将冰冻的含虫卵的粪便样品取出，于清水中融化，放入沸水中煮10 min， 12 000 r/min离心5 min，除去少量上清液后，将剩余的液体和沉淀移入2 mL的EP管中，并重悬；将EP管放入沸水中煮5 min， 12 000 r/min离心5 min；去上清液，各管中分别加入2% Triton X-100及KOH各200 μL，振荡器振荡混匀，12 000 r/min离心5 min，去上清液，再加2% Triton X-100及KOH各200 μL反复进行此过程，直至上清液变清澈；去上清液，每管加入800 μL蔗糖/KCl溶液，并充分振荡均匀后， 12 000 r/min离心8 min；将上清液移入新的2 mL EP管中，蒸馏水加满，12 000 r/min离心10 min，去上清液，重复加满蒸馏水，清洗沉淀，至最后残留200 μL沉淀物及液体；用组织匀浆机匀浆残留的沉淀物及液体； 12 000 r/min离心5 min，留取上清液并移入新管中，沸水煮5 min，作为PCR模板。
1.2.4 引物的设计与选择 引物设计根据华支睾吸虫基因，用Primer 5.0设计2对引物如下。
第1对：上游引物Cs1-1：5′-TTAGAGGAGTTG
GTGTCCCC-3′，下游引物Cs1-2：5′-AGCGTCACTG
AACCACACCCAC-3′；
第2对：上游引物Cs2-1：5′-TGGCCTGACTG
GCTGGCCGG-3′，下游引物Cs2-2：5′-CGGCACCC
CACACACATACA-3′。
用Primer 5.0分析软件分析其可行性，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2.5 PCR条件的优化 PCR 特异性扩增：PCR反应成分为10×PCR Buffer液（含Mg2+）4 μL，2 mmol/L dNTP 2.5～3.0 μL，10 pmol/L上、下游引物各0.5 μL，DNA模板5～6 μL，Taq DNA聚合酶0.25～0.50 μL，灭菌去离子水加至50 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、55～60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃延伸5 min、4 ℃保存。观察2种引物条带清晰程度来进行最适引物的选择。
1.2.6 琼脂糖凝胶电泳检测 用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳缓冲液为0.5×TBE，加入少许溴化乙锭（EB）使其终浓度为0.5 μg/mL。将上样缓冲液与扩增产物以1∶10比例混匀，加样至样品孔中，以lower DNA Marker为标准分子量。用5 V/cm的电压进行电泳，当溴酚蓝至适当位置后，切断电源，在紫外投射反射仪上观察电泳结果并拍照。
1.2.7 连接载体与基因测序 将PCR扩增产物大量回收，用DNA凝胶回收试剂盒回收DNA，然后与T载体进行连接，送上海生工生物工程有限公司进行核苷酸序列测定，运用NCBI中的BLAST工具将测序结果与基因库内的基因序列进行比对并进行同源性分析。
2 结果
2.1 PCR优化结果
分别对PCR反应体系中的dNTP量、模板量、引物量和Taq DNA聚合酶用量进行优化，拟在55～60 ℃的区间内对退火温度进行摸索，2对引物进行优化后最佳结果见图1、图2。结果显示第2对引物（图2）出现的条带最清晰，而且多次检测准确度高，因此选择第2对引物作为最适引物，摸索后的最佳反应条件为：扩增条件为94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min、4 ℃保存。最佳反应体系见表1。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果显示除阴性对照未见条带外，其余各样本均可扩增出大小约为255 bp的特异性条带（图2）。
2.2 基因序列比对结果
扩增产物的测序结果应用BLAST工具进行比对后，发现其与华支睾吸虫基因的内转录间隔区2（ITS2）：中国沈阳分离株（AF217099）和朝鲜分离株（AF217094）的同源性为100%，证实扩增产物为华支睾吸虫基因的其中一个片段（图3）。
3 小结与讨论
华支睾吸虫病的实验室诊断主要包括病原学方法和免疫学方法，分子生物学诊断方法尚未建立。病原学检查以粪便镜检虫卵为主要方法。由于在人体内寄生的华支睾吸虫虫卵数一般不多，排卵数量较少，虫卵形态又非常小，该法极易漏诊。免疫学诊断技术因其具有较高敏感性和特异性，操作简便易行，但现已研制出的免疫学诊断方法因使用的抗原非特异性或敏感性低，而主要应用于临床辅助诊断中[8]。近年来，随着分子生物学的发展，聚合酶链式反应（PCR）因其较高的敏感性、特异性以及能够提供病原微生物在体内存在的直接证据而在临床诊断中展示了广阔的应用前景[9，10]。本试验运用PCR技术检测自然感染华支睾吸虫病患者粪便中的虫卵，设计多对引物进行选择，优化试验结果。因粪便中干扰因素较多，故基因组DNA的成功提取以及稳定的PCR反应体系的建立便成为开展该方面研究的前提，下一步可以利用虫卵数对感染程度的影响进行PCR定量研究，为进一步探索分子生物学方法在华支睾吸虫病诊断中的应用奠定基础。
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