摘要：目的 人工合成的骨替代材料在治疗部分类型的骨缺损时往往存在疗效的不确定性，特别是在大范围的骨缺损的修复中存在较高的失败率，因此需迫切寻找新的解决途径。丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物学性能，本研究拟改善丝素蛋白的骨诱导性能。方法 采用共沉积法制备了丝素蛋白/钙磷复合材料，制备腺病毒Ad-BMP-2，然后制备丝素蛋白/钙磷复合基因支架。将骨间充质细胞培养于其上，并采用扫描电镜（SEM）观察细胞的贴附，及检测细胞增殖、分化的性能进行观察。结果 SEM观察显示生物材料具有良好的孔径；制备了Ad-BMP2腺病毒，病毒表达GFP绿色荧光蛋白；细胞学检测发现该生物支架生物相容性好，细胞呈梭形，舒展充分，细胞核处隆起，细胞周围可见基质附着。结论 该生物材料具有良好的孔径及生物相容性，具有良好的应用前景。
关键词：丝素蛋白；钙磷复合材料；BMP-2；腺病毒
生物医学组织工程是近年来继基因工程之后取得重大技术突破的生命科学领域新的研究热点。组织工程的三大要素是：具有增殖分化潜能的种子细胞、生物支架材料、生长因子。组织工程核心技术在于构建细胞与生物材料复合物。细胞外基质是构建组织工程化牙周组织的物质基础，细胞在三维支架材料中不断生长、增殖，并分泌细胞外基质取代逐渐降解的生物材料，最终形成具有活力的组织。本研究将丝素蛋白与磷酸钙粉末混合，可使无机粉末均匀分布于丝素蛋白中，避免了无机粉末由于静电作用互相聚集的倾向，利用仿生共沉积的方法获得丝素蛋白磷酸钙复合物，并结合BMP-2腺病毒，制备出丝素蛋白/钙磷复合基因支架。
1 资料与方法
1.1丝素蛋白的制备 丝素蛋白的制备：①家蚕生丝脱胶 家蚕生丝置于约0.5‰的无水碳酸钠溶液中，于90℃～100℃处理30min，重复3次，以脱去蚕丝中的丝胶。脱胶后洗净，烘箱60℃烘干后得到精炼蚕丝；②丝素纤维溶解：配置CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩尔比1：2：8）三元溶液。于（70±2）℃在三元溶液中搅拌溶解拉松的家蚕精炼丝纤维，浴比1：10，时间1h，得到混合溶液；③透析将丝素溶液装入透析袋，在流动自来水中透析48h之后换用去离子水，换1次/h水，持续48h。经透析得到纯家蚕丝素蛋白溶液，溶液经纱布过滤装入试剂瓶中保存于冰箱备用；④家蚕丝素蛋白溶液的浓缩：将纯家蚕丝素蛋白溶液倒入玻璃表面皿，于45℃搅拌，用电扇吹加速其水分的蒸发，浓缩过程持续24h。蒸发浓缩过程中防止表面结膜和表面起泡沫。
1.2磷酸钙/丝素蛋白复合物的制备 将0.588g CaCl2·2H2O溶解于40ml乙醇中，得到入氯化钙乙醇溶液；将0.374 g of NaH2PO4·2H2O、2g丝素蛋白溶液溶解于24L去离子水中；逐步滴加氯化钙乙醇溶解液，并在滴加过程中搅拌，之后静置18～48h，得到沉淀的混合物。
将所得的沉淀物去离子水过滤漂洗3次，乙醇漂洗后一次后40℃真空干燥，得到磷酸钙丝素混合粉末。将混合物加入5%的丝素蛋白溶液中并搅拌，获得终浓度为5%的溶液。所得溶液4℃保持0～90min，-20℃～-80℃之间过夜后真空冷冻干燥，所得的复合多孔支架材料经过30%～100%的乙醇容易处理。
1.3质粒提取及病毒的合成 真核表达质粒PcDNA3.0-BMP-2由本人构建并保存[1]，首先制备腺病毒穿梭质粒的构建pAdTrackCMV-BMP-2， 并制备包含pAdEasy I 质粒的BJ5I83电穿孔感受态菌，得到pAd-BMP-2。
制备重组腺病毒Ad-BMP-2：取10μg pAd-BMP-2病毒质粒及阳性对照质粒pAdEasyI用Pac I 37℃酶切，线性化并回收。将上述pAd-BMP-2质粒用PacI酶切回收后取5μg线性化质粒，稀释入无血清培养液中，同时将10μl lipofectamine2000稀释入无血清培养液中，室温放置5min。将稀释的腺病毒DNA和lipofectamine2000混合后室温放置20min。吸出原先含血清的培养液，加入含DNA-lipofectamine复合体的无血清培养液，24h后更换含10%小牛血清的新鲜培液，1d后开始定时观察细胞毒效应。24～48h后通过荧光显微镜观察EGFP的表达以确定转染及病毒包装成功。7～10d后可观察细胞病理变化出现，同时表达EGFP的细胞数逐渐增多，此时收集293细胞于液氮和37℃水浴中反复冻融4次，离心取上清的1/2重新感染HEK293细胞进行扩增，5d后收集细胞，1500 r.p.m离心7 min小心弃上清以2ml PBS重悬，反复冻融4次，重复感染、收集步骤，如此反复进行5次后制备高滴度腺病毒。收集第5代病毒进行滴度（pfu/L）测定。
1.4丝素蛋白/钙磷复合基因支架的制备及细胞培养实验 将丝素蛋白/钙磷复合材料置于在无菌操作台内，将病毒液滴于支架上，使之浸润，1ml 的腺病毒溶液滴到1mg 的干燥的丝素蛋白/钙磷复合材料支架上，4℃ 过夜使支架与质粒或腺病毒充分结合，然后-80℃放置2h成型后移入冷冻干燥机干燥。
将骨间充质细胞（BMSCs）接种于丝素蛋白/钙磷复合基因支架上，进行常规细胞培养，并在第5d进行电镜观察。
2 结果
2.1本方法制得的磷酸钙与丝素蛋白具有改善的交界；复合支架材料外部、内部孔径孔隙率一致，孔分布均匀； 制备的支架底部无明显的磷酸钙聚集。图1显示本方法所获的磷酸钙丝素蛋白复合多孔支架，磷酸钙在丝素蛋白中分布均匀，支架孔隙连通率高。
图1 复合支架的扫描电镜图片，磷酸钙与丝素蛋白具有改善的交界；复合支架材料外部、内部孔径孔隙率一致，孔分布均匀； 制备的支架底部无明显的磷酸钙聚集。
2.2 pAd-PDGFB质粒经Pac I酶切线性化后在lipofectamine2000介导下转染HEK293细胞，1d后荧光显微镜下见约10%的细胞表达EGFP（图2，图3），以后逐天增加，3d后可见大量细胞均表达EGFP（图4，图5），当第7d细胞开始大量脱落并呈串状时收集细胞。正常对照细胞则无此变化。将病毒滴度调整为2×1010 particles/ml.（表达形成单位/ml）。
2.3将细胞接种于复合基因支架，生物相容性好，所获的复合支架材料由于表达BMP-2因此理论上具有骨诱导性，同时机械强度未下降。图6显示生物材料具有适合细胞生长的孔径，细胞伸展附着较好。
3 讨论
外源性生长因子的引入可促进骨再生，然而外源性生长因子半衰期较短，要求相对大的剂量才能刺激足量的组织形成而发挥治疗作用，增加了临床应用成本并可能导致毒性作用的产生，同时应用外源性生长因子还存在需反复给药、易流失和效率低等缺点。随着基因技术的发展，通过转移技术来实现生长因子内源化的方法已逐渐成熟。将有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞，以维持较高的生长因子浓度，促进组织愈合及再生。这样就避免了应用外源性生长因子蛋白所带来的弊病，在骨再生及组织工程中有广阔的应用前景。基因传递系统的载体分为病毒载体系统和非病毒载体系统[2]。非病毒载体主要为质粒DNA、脂质体-DNA复合物、分子耦联载体等，其具有毒性及免疫反应低，稳定，抗原性小，质粒DNA易于获取容易，但其基因转移率低，而且不能长期表达，组织的特异性不高，需要大量、持续、反复使用，且基因表达时间短。常见的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、人细胞巨化病毒等。逆转录病毒、慢病毒在及腺病毒相关病毒rAAV体内呈损失性感染，其免疫反应低。Sugiyama等学者用用慢病毒介导BMP-2先体外后体内基因观察肌肉内成骨，发现BMP-2促进骨再生，植入8w后BMP-2仍然持续表达，显示了慢病毒在骨再生治疗中的前景[3]。腺病毒是最常用于骨缺损修复的基因载体[4]，它可插入7.5kb的外源基因，且相对稳定，能纯化和浓缩，它存在以下优点：可感染分裂及非分裂期的细胞；腺病毒载体无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低。重组腺病毒构建较早使用的是双质粒转染法，将目的基因亚克隆至穿梭质粒中构建成转移质粒，再与腺病毒基因组质粒共转染293细胞，两质粒借所带的部分同源序列在293细胞内发生同源重组而形成重组体，并进一步包装成重组腺病毒颗粒。因为该种制备方法要求两种质粒的共转染及同源重组必须同时发生在293细胞内，才有可能形成重组体并包装成病毒，由于细胞内质粒共转染效率较低，同源重组效率更低。目前较多使用的为AdEasy系统[5]，其腺病毒质粒同源重组在大肠杆菌中高效进行，且细菌繁殖快，同源重组能力强，因而从根本上克服细胞内同源重组率低的缺陷。同时由于在腺病毒骨架中含有的EGFP报告基因，便于监测病毒是否包装成功，大大减少了病毒的制备时间。
有学者利用饱和磷酸钙在仿生液中的析出特性，将生长因子与磷酸钙沉积于种植体表面，形成一层三维的晶格，生长因子在第五周仍然缓慢释放，促进了骨的愈合，显示了生长因子通过共沉积达到缓释的潜质[6]。然而，该沉积方法获得的支架的三维孔状结构及表面孔隙不可避免的部分丧失[6，7]。也有学者通过熔盐浸取法获得的CaP复合支架，然而存在机械强度不足的缺点[8]。电沉积法可通过改变电压电流获得良好的表面形貌和化学成分[9]，然而在最佳点沉积条件下的PH值和温度均不会破坏生长因子的活性。丝素蛋白由于良好的机械性能及生物相容性及可降解性[10-11]作为组织工程材料已广泛应用。本实验将丝素蛋白与磷酸钙粉末混合，可使无机粉末均匀分布于丝素蛋白中，避免无机粉末由于静电作用互相聚集的倾向。利用仿生共沉积的方法获得丝素蛋白磷酸钙复合物，再与组织工程支架结合，有望获得均匀孔径的三维支架，随着丝素蛋白与多孔生物陶瓷支架结合，可改进其机械性能，同时生长因子随着磷酸钙的溶解而释放而达到缓释的目的。
本方法所获的磷酸钙丝素蛋白复合多孔支架细胞生物相容性好，制作过程无需添加有毒的化学偶联剂，工艺流程简单； 磷酸钙与丝素蛋白具有改善的交界； 磷酸钙在丝素蛋白中分布均匀，支架孔隙连通率高。复合支架材料外部、内部孔径孔隙率一致，孔分布均匀； 制备的支架底部无明显的磷酸钙聚集。所获的复合支架材料具有骨诱导性，同时机械强度未下降。生物材料具有适合细胞生长的孔径，同时缓释BMP-2基因，可应用于组织工程支架领域，以替代自体骨移植等，具有广泛的应用前景。
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编辑/哈涛
