摘要：本文阐明了杀虫剂穿透生物学的基本概念及其对昆虫抗药性测定的指导意义，论述了杀虫剂穿透生物学提出的背景及其与田间毒理学的关系，分析了在昆虫抗药性测定中存在的问题及其主要原因；提出了杀虫剂穿透生物学在昆虫抗药性测定中的应用原则。
关键词：杀虫剂；穿透生物学；抗药性测定
中图分类号：S481.1；S482.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942(2010)10-0085-05
杀虫剂穿透毒理是昆虫毒理学重要的研究领域，因为杀虫剂对昆虫的穿透是其发挥毒杀效果的第一前提。现代有机合成的杀虫剂大多具有一种以上进入昆虫体内的途径即作用方式，杀虫剂的生物测定尤其是在室内活性筛选的过程中，一般是根据化合物本身所具有的作用方式而确定相应的测定方法，再根据试验结果判断化合物的生物活性。这种生物活性显然只是一个初步的实验室评估结论，如果要真正开发一个商品的杀虫剂必须在田间条件下进行药效的鉴定，也就是说最终考察一个化合物对某靶标昆虫的生物活性必须由田间试验予以确定。这是因为杀虫剂的使用总是在田间环境下进行，其药效受到实际的用药方式、药剂穿透形式、环境条件以及靶标昆虫的生物学行为的综合影响，因而与实验室测定的结果不完全吻合，有时甚至可能完全相反。
昆虫抗药性是在田间用药条件下有害昆虫形成的一种适应性变化，其形成速度和机制受制于药剂进入昆虫体内的穿透行为。目前国内外关于昆虫抗药性的研究与测定很少考虑田间条件药剂的穿透行为的影响。弄清楚两者间的关系对于正确理解昆虫抗药性的形成及其测定方法具有重要的理论和实践意义。
杀虫剂穿透生物学就是关于杀虫剂在田间状态下的穿透途径及其速率与药剂的物理状态、昆虫行为学习性及其环境条件之间关系的科学。该概念回答了三个问题，即作为抗性机理研究的供试材料均源于实验室条件下药剂特定胁迫穿透模式汰选的“人工”抗性种群，是否具有合理性，抗性测定方法的选择需要遵循何种原则才能保证其测定结果最大限度地符合田间的实际抗性水平，实验室测定时设定的条件如何真实地反映田间环境下的药剂穿透速率的变化。提出该概念旨在强调抗性机制的研究及其抗性检测必须充分考虑抗药性与田间环境条件的联系，尤其是与昆虫在自然条件下的生物学行为的关系；抗性的测定或检测方法必须建立在药剂穿透生物学理论的基础上才能还原昆虫抗药性发展的历程及其形成机制。
1、杀虫剂穿透生物学提出的背景及其理论渊源
害虫对化学药剂的抗药性历史不到100年，就已经有600多种害虫对1种或多种药剂产生了抗药性，我国已有45种害虫产生抗药性，其中农业害虫36种。昆虫抗药性的产生和发展是在化学药剂的选择压力下昆虫的表皮穿透性、生化代谢以及作用靶标变化的结果。抗药性不仅导致化学防治的成本增加，也使农产品因有害生物危害的风险增加。
预测和评估害虫的抗性及其风险是科学地制定抗性治理策略的前提和基础。迄今为止昆虫抗药性检测主要采用生物检测法、神经电生理检测法、生物化学检测法、免疫学检测法、分子生物学检测法等。其中生物检测法即生物测定法仍然是最经典、最基础的方法，即根据药剂作用方式和昆虫种类建立标准的抗性检测方法，使用该方法建立一个敏感种群的毒力基线，再以此为依据对田间种群的毒力进行比较，从而确定其抗性的变化及其程度。
1956年世界卫生组织召开了一系列的抗性测定方法的讨论会，于1970年制定出标准的测定方法。联合国粮农组织也在1969-1974年先后发表了测定原理及15种农药抗性测定的试行方案。据此我国也制定了24种重要农业害虫抗药性测定标准方法和试行方法。但这些标准制定的依据均是昆虫形态和药剂作用方式，故对同一种害虫一般推荐了一种以上的测试方法及与之相应的测定虫龄。由于受到传统的毒力测定“量化和精准”概念的束缚，国内外推荐的测定标准大多采用点滴法，就象蚜虫这样小型的昆虫亦推荐点滴法。可以预期纯室内测试方法(点滴法)得到的结果与田间实际情况的符合性必然较低。因为点滴法所用药剂存在的物理状态、药剂对昆虫的穿透方式与田间条件下存在着本质区别。点滴法是药剂经过有机溶剂溶解后的溶液状态下强制通过昆虫的胸部背板进入，而田间条件下药剂显然是以水乳剂多半通过昆虫体壁的其它部位尤其是跗节或者包括消化道在内的综合穿透途径进入。昆虫生理学研究表明，昆虫的跗节或前跗节与胸、腹部体壁的构造有很大差别，中肠与体壁的构造存在更大的差异”。这可能是导致许多研究结果与生产实践不一致的主要原因。比如：依据实验室测得的区分剂量在具体应用时总要设计一个所谓的“系数”，即便如此监测结果也不如使用药剂田间推荐剂量所得到的结论更符合田间的抗药性实际状况；基于传统研究方法关于抗性机制的研究认为穿透抗性只在极少条件下发生且并不是主要的抗性机理，而事实上在害虫抗性治理中广泛地使用了渗透剂的技术策略。此外，由于同种昆虫或相同药剂对同一种测试对象存在1种以上的测定标准，导致大量类似的研究结果无法相互比较，进而在很大程度上丧失了科学价值。
赵善欢在研究杀虫剂的毒力与药效的关系时，曾经提出“田间毒理学”的概念，指出在探讨杀虫剂田间的作用及实际药效时，仅以分子生物学、分子毒理学为基础来研究杀虫剂对昆虫个体生化、生理的影响及其作用机制是不够的，还必须研究田间各种生态因素及昆虫种群的结构与动态对杀虫剂田间药效的影响，并强调有些情况下杀虫剂的毒力需要在田间条件下进行测定。显然很多年前科学家已经注意到昆虫毒理学的研究离不开田间条件下杀虫剂对靶标害虫种群生长发育的影响。只是因为昆虫作为一种可以独立于寄主生存的有机个体，以及实验室研究条件的可控性等，昆虫毒理学包括杀虫剂抗药性的研究未受到足够的重视，以至于“田间毒理学”的概念并未受到广泛的关注。重新评价“田间毒理学”的意义并在此基础上阐明“杀虫剂穿透生物学”的理论，对于指导昆虫抗药性研究的实践是一件重要而且十分紧迫的任务。
2、从穿透生物学视角讨论昆虫抗药性测定与防治效果间的关系
所有关于昆虫抗药性的标准方法包括WTO、FAO、IRAC以及国内推荐的重要卫生与农业害虫的测定方法的制定依据均基于昆虫的形态和药剂的作用方式。由于现代有机合成杀虫剂均具有良好的触杀活性，且点滴法被公认为最具精确性和定量化的特点，故在国内外推荐用于农业害虫抗性测定的标准中优先考虑了该法。但是这一方法所依据的原理以及药剂的穿透方式恰恰与药剂实际使用时的状况差异最大。这就必然导致了抗性研究的结论往往与生产实践不能完全吻合。事实上在很多情况下室内生物测定夸大了抗药性的重要性。如用点滴法测定烟芽夜蛾对菊酯的抗药性超过50倍，这与田间防效降低的情形没有完
全的关联性；用于测定该虫对灭多威的抗性指数高达850倍以上，而田间防效仅从64％下降到39％。吴益东等(1996)用点滴法和浸叶法测定棉铃虫对氯氰菊酯、灭多威和久效磷的抗药性，结果表明点滴法测得对氯氰菊酯的抗性倍数为20.8-34.8倍，而浸叶法为2.0-18.7倍；点滴法测得对灭多威的抗性倍数为5.4-16.4倍，而浸叶法为1.4-6.5倍；点滴法测得对久效磷的抗性倍数为2.8-9.3倍，而浸叶法为11.3-70.1倍。可见，浸叶法中对氯氰菊酯和灭多威的抗性倍数，总是小于相应种群在点滴法中的抗性倍数；而浸叶法中对久效磷的抗性倍数总是大于相应种群在点滴法中对久效磷的抗性倍数。与田间防治效果相比较证明，浸叶法所测结果更符合当地棉铃虫田间抗性水平。说明不同的测定方法所得到的抗性结果存在较大差异，同一种测定方法应用不同的药剂所得到的结果的符合性也存在明显差异。产生这种差异可能源于不同药剂的作用方式的差异以及两种测定方法中所用药剂的技术等级不同，即点滴法使用的是原药而浸叶法使用的是制剂。但是，点滴法所测抗性水平从理论上说应该低于浸叶法，因为点滴法使用的药剂是经过有机溶剂溶解后的稀释液，应该更容易穿透昆虫的体壁；同时在氯氰菊酯、灭多威和久效磷之间存在相反的关系，即测定方法与测定结果呈现较为复杂的关系。因而杀虫剂穿透生物学的改变才是导致这些结果的最本质的原因。
实践还证明，田间环境尤其是温度会改变药剂进入昆虫体内的方式或者昆虫自身的生理状态。赵建周等(1996)利用田间推荐剂量作为区分剂量研究小菜蛾对啶虫隆的抗药性时发现，其抗药性频率的增加发生于6-10月，其它时期保持稳定，此变化与当地田间药效的变化相一致。郭莹等(2004)在研究小菜蛾对毒死蜱与温度的关系时亦发现在10-30℃范围内低温饲养的小菜蛾对试验药剂更敏感。这说明温度可能会改变药剂的穿透行为，或者说昆虫的抗药性实际上是一个动态的变化过程，也就是说杀虫剂穿透生物学还包括温度等外部条件对药剂穿透行为可能产生的影响。
一般来说，杀虫剂喷洒在寄主植物上后进入昆虫体内的途径一般可区分为3种复合模式。(1)药剂直接喷洒在昆虫体上后，主要从昆虫体壁或消化道进入。某些活动性较弱的种类如蚜虫、螨类、蚧壳虫等，药剂多半是按此模式进入昆虫体内；触杀性较强的药剂主要是通过体壁进入；兼具触杀和内吸作用的药剂可能通过昆虫刺吸植物汁液而从消化道被摄入。(2)药剂喷洒在寄主植物上后昆虫在受药表面爬行时，药剂主要从昆虫跗节或消化道进入。某些活动性较强的种类如夜蛾科昆虫，药剂一般很难直接喷洒到昆虫体上，多半是通过它们在受药表面爬行而摄入。对这些昆虫的抗性测定如采取点滴法进行，所得结论一般很难符合实际情况。(3)药剂施用后主要通过渗透作用到达昆虫活动部位，通过昆虫消化道或体壁进入昆虫体内。钻蛀性昆虫如螟虫、实蝇类幼虫、潜叶蛾幼虫等的受药方式主要是通过这种模式。对这些昆虫的抗性测定如采用点滴法则与实际情况相去更远。事实上在国内外推荐的抗药性测定标准中，后两者模式恰恰首推的就是点滴法。基于杀虫剂穿透生物学的理论，要使抗性测定的结果比较符合田间药效的变化，必须尽可能模拟在田间条件下该药剂对靶标害虫的穿透模式，并在与大田相似的温度条件下进行测定。比如，陈年春等采用点滴法、浸叶法和浸渍法测定拟除虫菊酯和有机磷杀虫剂对棉蚜的抗性，结果表明，浸叶法效果最好，重复性高，适应性好，毒力曲线的b值最高；对溴氰菊酯的抗性测定结果表明，点滴法比浸叶法更符合田间实际抗性水平，前者测得的LC50为>50000 mg/L，后者仅256.5 mg/L，从而得出浸叶法更符合田间条件下药剂对蚜虫的穿透模式，再次证明了杀虫剂穿透生物学对于抗性测定方法的重要指导意义。需要强调的是评价一个具体的生测标准是否具有适用性，最终必须考察其毒力曲线计算所得的区分剂量(LD99)是否与田间防治效果具有一致性，这显然过去未注意到。
3、杀虫剂穿透生物学与抗性测定方法的关系
杀虫剂穿透生物学的意义概括起来可以表现在两方面：一是指导杀虫剂应用时必须选择最符合其穿透途径的用药方法和时间；二是指导抗性测定时其测定原理必须尽可能符合药剂在田间状态下一般的穿透模式。中华人民共和国农业部为国内杀虫剂新品种登记的需要陆续制定了《农药室内生物测定试验准则——杀虫剂》，其中推荐的方法包括点滴法、夹毒叶片法、锥形瓶法、连续浸液法、浸渍法、药膜法、喷雾法、人工饲料混药法、稻茎浸渍法、玻片浸渍法、浸叶法等。这些方法考虑到了杀虫剂的大多数作用方式以及昆虫的生物学习性对生物测定方法的要求，但未充分考虑田间条件下药剂的穿透生物学行为。为此基于杀虫剂穿透生物学的基本原理，对昆虫抗药性的测定或监测，需要建立一批更为科学和标准的试验准则。具体来说，研究一个具体的测试对象的测定标准时应考虑以下原则。
①测试对象的生物学特性：昆虫测试虫态的活动特点如活动性强弱、昼夜节律等，取食习性如表面、潜叶或蛀茎取食等，口器类型如刺吸式、咀嚼式等。
②昆虫主要危害世代的环境温度：昆虫生长发育的温度会影响其对药剂的敏感性，如在10-30℃的范围内，低温饲养的小菜蛾比高温饲养的对药剂更为敏感；赵建周等(1996)发现小菜蛾在年生活史中对杀虫剂的敏感性变化呈现一定的节律性。因而，抗性测定时控制的温湿度最好与实际情况相一致。
③药剂的处理方式：药剂的处理方式直接决定了药剂的穿透途径。如点滴法处理昆虫时，药剂只能局部地通过胸部背板进入昆虫体内；药膜法处理时，药剂可以从昆虫体壁的各部分进入；浸叶法和喷雾法处理时，药剂可同时从体壁、消化道或气门进入。显然药剂不同的穿透途径到达作用靶标的难易和过程不同，穿透过程中药剂的主要代谢方式亦不同，从而昆虫的抗性机制也随之不同。因此抗性测定过程中所采取的药剂处理方式如果与田间实际情况相去太远，所测结果就不能真实地反映昆虫抗药性的实际水平。这就是前面已经论述过的某些测定方式与实际情况完全不相符合的主要原因。
④药剂的物理状态：抗性测定是要确定某种药剂使用一段时间后田间生物活性的变化情况，因此测定方法必须要与药剂的穿透生物学特点相适应，也就是要最大可能地模拟药剂实际的穿透模式。除处理方法外，还必须考虑药剂使用时的物理状态。对于田间主要的施药方式——喷雾法而言，药剂均是以水乳剂的形式存在，因此点滴法、药膜法所用药剂的物理状态与田间情况下不一致。药剂的物理状态势必直接影响其穿透途径，这就是为什么大多数研究结果均证明浸叶法、喷雾法和浸渍法更适合抗性生物测定的主要原因。
⑤寄主植物的生物学特点：在杀虫剂抗性测
定过程中，寄主的生物学特点会间接影响到药剂的测定结果。因为寄主植物的生物学特性会影响到药液雾滴的沉降方式以及对药剂的吸附性能，从而影响到药剂对昆虫体壁的穿透模式。如使用药膜法测定昆虫的抗性时，理论上来说药剂对昆虫的穿透模式与田间情形是相似的，但使用滤纸或玻璃瓶制作的药膜与药剂在寄主植物上形成的药膜肯定是存在差别的。即使同在实验室条件下，滤纸药膜和玻璃瓶药膜也有很多不同。比如药剂的成膜方式、药剂的吸附特点、昆虫与药膜的接触形式等都可能存在较大的差异。寄主植物其表面的构造特点与滤纸或玻璃瓶更是完全不同，它们表面的蜡质构造以及其上的突起或者毛、刺等物理结构会直接影响到药剂的吸附和释放行为，昆虫还会通过口器直接对寄主进行取食等生物学行为。这些均会导致药剂的穿透模式出现较大差异从而影响到药剂的毒力变化。此外药剂在寄主植物表面的沉降方式与实验室药膜的制作情况也有较大差异。因此在抗性测定时必须引入寄主因素。这也是愈来愈多的研究者更倾向于使用浸叶法、喷雾法、叶碟法等进行杀虫剂抗性测定的本质原因。
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