对照组（n=10）。按照60 mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立糖尿病大鼠模型。于STZ注射前和注射后第7、14、28天分别测定大鼠血糖、体重以及机械性痛阈的变化。造模组又均分为造模1周组、造模2周组、造模4周组三个亚组。在造模前及造模后1、2、4周利用von Frey hairs法测定大鼠机械痛阈，并通过Real-time法测定每个时间点大鼠脊髓背根神经节（DRG）P2X3受体的表达水平。 结果 肉眼观察糖尿病大鼠毛色暗淡，尾静脉采血点愈合缓慢，每日饮水，饮食，尿量显著增加，表现符合糖尿病大鼠的临床特征。各模型组血糖浓度均>16.7 mmol/L，各模型组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。糖尿病大鼠体重较对照组同期大鼠增长缓慢，差异有统计学意义（P<0.01）。造模组机械痛阈在造模1周后明显下降（P<0.01），并持续至4周（P<0.01）；在造模1周后脊髓DRG内P2X3受体表达水平出现显著上调（P<0.01）。大鼠P2X3受体表达水平变化与机械痛阈的下降存在相关性。 结论 糖尿病早期大鼠脊髓DRG P2X3受体表达即出现上调，并与疼痛相关，说明P2X3受体可能在糖尿病大鼠周围神经疼痛的发生及痛敏的维持阶段起重要作用。
[关键词] 糖尿病；P2X3受体；背根神经节；Real-time法；大鼠
[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（c）-0004-04
糖尿病的发病率随着生活水平的提高不断上升，严重危害人们的健康，神经病理性疼痛是目前危害糖尿病患者的主要慢性并发症之一，临床表现为感觉异常和疼痛，其中对机械刺激表现异常疼痛，称为痛性糖尿病周围神经病，由于机制尚不明确，很难治疗或无法治愈[1-5]。P2X3受体的基本结构属于配体门控离子通道，P2X3受体亚基最初由脊髓背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）分离出来[6-7]。神经损伤后组织释放大量ATP，一方面激活突触后膜P2X3受体，使细胞膜去极化，Ca2+内流，介导快速突触传递；另一方面激活突触前膜P2X3受体，促使谷氨酸释放[8]，通过NMDA和非NMDA系统，介导疼痛信息。本研究旨在建立糖尿病神经病理性疼痛大鼠模型，探讨P2X3受体在其疾病发展过程中的作用，为临床治疗提供依据。
1 资料与方法
1.1 糖尿病神经病理性疼痛大鼠模型的制备及分组
健康成年雄性SD大鼠，体重180～220 g，将其随机分为造模组（n=30）和对照组（n=10），造模组按照不同时间点分为造模1周组、造模2周组、造模4周组，每组10只；应用国际通用的链脲佐菌素（Streptozocin，STZ，Sigma公司）腹腔注射建立糖尿病大鼠模型[9]。大鼠禁食水12 h后，腹腔一次性按照60 mg/kg剂量注射STZ，于注射后48 h，测量尾静脉空腹血糖，如果血糖浓度>16.7 mmol/L，认为造模成功。对照组仅注射相同剂量蒸馏水。
1.2 血糖和体重测定
造模48 h后，应用血糖仪对所有大鼠进行尾静脉空腹血糖测定；于造模前及造模后1、2、4周进行体重测定。
1.3 痛行为学观察
于造模前和造模后1、2、4周对大鼠进行机械痛阈值的测定。固定时间点（上午10：00～12：00），在固定的地点，室内环境尽可能安静舒适（室温维持在23℃左右，湿度55%左右）的情况下，给予人为机械刺激，观察大鼠的痛行为改变。主要采用von Frey细丝法，不同规格的von Frey细丝（0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、1.0 g）垂直刺激大鼠后足足心处，持续5～10 s，出现明显缩足、舔足或抬足行为均视为阳性反应。刺激强度从弱到强，重复10次，每间隔3～5 min一次，10次中有6次以上阳性反应的最小刺激强度视为机械性痛阈值。
1.4 Real-time观察P2X3受体蛋白表达
随机取不同组5只SD大鼠，乙醚麻醉后，获取L4～6 DRG神经元，置于冰上放置的玻璃研磨器中，加入1 ml的Trizol（Gibico公司），迅速研磨至无肉眼可见组织块。5 min后将各组裂解液吸到1.5 ml RNase EP管中，加入氯仿0.2 ml/管，剧烈振摇15 s，静置2～5 min。4℃，12 000 r/min，离心10 min。离心后液体分为三层（上层——无色水样层为RNA，中层白色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一个新的RNase EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置10～30 min，离心（4℃，12 000 r/min，10 min）。弃去上清，沉淀加入冰冷75%乙醇1 ml，漂洗，用移液抢吸取液体，干燥10～20 min，加入20 μl DEPC水溶解，分装，-80℃冰箱保存备用。RNA经逆转录反应合成cDNA，RT及PCR反应体系（Promega公司）按试剂盒说明书进行。实验结果采用Real-time实验中目标基因的CT值通过GAPDH的CT值均一化，即ΔCT=CT目标-CTGAPDH，而目标基因mRNA相对丰度值以ΔΔCT值（DD value）表示，ΔΔCT=2-ΔCT。
P2X3引物序列为F：5′-CAACTTCAGGTTTGCCAA-3′；R：5′-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3′。
1.5 统计学分析
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 观察
肉眼观察糖尿病大鼠毛色暗淡，尾静脉采血点愈合缓慢，每日饮水，饮食，尿量显著增加。以上表现符合糖尿病大鼠的临床特征。
2.2 血糖与体重
造模后对照组大鼠血糖始终在4～6 mmol/L，其他各模型组血糖浓度均>16.7 mmol/L，各模型组与对照组之间比较，差异有统计学意义（P<0.01）（表1），提示糖尿病大鼠模型成功建立。体重监测结果提示，糖尿病大鼠体重较对照组同期大鼠增长缓慢，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。
2.3 机械痛阈
造模前及造模后7 d，大鼠活动自如，无舔足及明显缩足反应，足底皮肤无改变，造模7 d开始出现明显的上述行为异常表现，机械痛阈明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）（表3）。
2.4 Real-time P2X3受体蛋白mRNA表达的变化
造模1周后P2X3受体蛋白mRNA表达有所增加，造模2、4周均呈现表达增加趋势，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）（图1）。
3 讨论
糖尿病周围神经病变是困扰糖尿病患者的主要并发症之一，其发病机制并未完全清楚，在不同领域都有所研究，如代谢方面、免疫因素、炎性因素、遗传因素等多方面都有关联[1-5]。本实验研究利用STZ成功建立了大鼠糖尿病神经病理性疼痛模型，观察到了随着时间的推移，模型组大鼠毛发无光泽，出现典型的“三多一少”的临床表现。造模1周后机械痛阈有所下降，一直持续至4周，说明在糖尿病神经病理性疼痛大鼠模型的早期就会出现痛觉感觉的异常，机械痛阈的下降，而且随着病情发展呈持续下降状态。P2X3受体是P2X受体家族中的成员，研究表明P2X3受体选择性地表达于初级传入感觉神经元如三叉神经节和结状神经节上，且以中、小型神经节细胞为主[10]，认为其是伤害性感受器活化的关键分子之一，与感觉神经末梢释放的ATP（P2X受体激动剂）结合而参与疼痛的信息传递，由此表明P2X3受体在疼痛的感知和传递中发挥着重要的作用，所以，近年来成为疼痛领域的研究热点。以往的研究中，人们建立了不同的动物模型，还有利用基因敲除等技术试图了解P2X3受体在疼痛的发生发展过程中的作用和意义，但其结果也不尽一致。如，Tsuzuki等[11]利用原位杂交方法研究发现，横断某些神经的分支后，P2X3受体mRNA在损伤的DRG神经元显著降低而在邻近未受损神经元却表达增加。在大鼠坐骨神经慢性结扎损伤（chronic constriction injury，CCI）模型，P2X3受体在中小神经元表达增多[12-13]。大鼠脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）模型DRG神经元P2X3受体表达减少，免疫活性下降[14-16]。慢性压迫损伤，三叉神经节P2X3受体免疫活性短暂增加[17-20]。本研究在糖尿病神经病理性疼痛模型成功建立基础上，发现随着病情的发生发展，利用Real-time方法检测脊髓初级神经元DRG中，发现P2X3受体的mRNA在DRG神经元呈逐渐高表达状态，在28 d仍表现为升高趋势，与之前的研究可能有所不同，之前的研究认为28 d P2X3受体蛋白表达有所下降，可能与实验方法不同有关，本研究仅限于mRNA水平，可能与部分mRNA未经转录发生了降解有关，有待于进一步研究确认。
综上所述，在大鼠糖尿病神经病理性疼痛模型病情发生发展过程中，随着机械痛阈的下降，出现DRG神经元P2X3受体mRNA表达的增加，提示P2X3受体可能参与了该病的发生发展，引发和维持了机械痛阈的下降和痛觉过敏的发生。
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（收稿日期：2014-09-10 本文编辑：郭静娟）
