邵玉蓝1 曹 岗2
1.浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州 310009；2.浙江中医药大学中药炮制技术中心，浙江杭州 311401
[摘要] 目的 建立近红外漫反射光谱技术与高效液相色谱（HPLC）相结合测定丹参饮片中丹参酮ⅡA的方法。 方法 采用透射模式采集样品近红外光谱数据，以偏最小二乘法建立光谱数据与HPLC法分析结果的定量校正模型，根据R、RMSEC、RMSEP等参数评价模型的定量性能；以准确性轮廓方法，验证近红外模型的准确度和精密度。 结果 所建立的丹参中丹参酮ⅡA定量模型中样品的预测值和真实值之间的决定系数（r）为89.92%，RMSECV为0.065。该法的建立证明了近红外漫反射光谱技术应用于中药中化学成分的测定的可行性。 结论 同其他测定方法相比该法操作简单、速度快、效率高、无污染、费用低、无需复杂的前处理， 可以直接对大量未知样品进行测定。
[关键词] 丹参饮片；HPLC；丹参酮ⅡA；近红外漫反射光谱；质量控制
[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）03（c）-0135-04
Rapid determination of tanshinone Ⅱ A in Radix Salviae Miltiorrhizae by near-infrared spectroscopy coupled with liquid chromatography
SHAO Yulan1 CAO Gang2
1.The First Affiliated Hospital of College of Medicine， Zhejiang University， Zhejiang Province， Hangzhou 310009， China； 2.Research Center of TCM Processing Technology， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Province， Hangzhou 311401， China
[Abstract] Objective To accurately determine of tanshinone Ⅱ A in Radix Salviae Miltiorrhizae by near-infrared （NIR） spectroscopy coupled with liquid chromatography techniques. Methods Transmission mode was used in the collection of NIR spectral samples. A robust PLS model was established based on the correlation between the NIR spectrum and HPLC reference. The quantitative property of the established model was evaluated through indexes of R， RMSEC， and RMSEP. The accuracy profile was introduced as a new method to validate the accuracy and trueness of the model. Results The results showed that the correlation coefficient of tanshinone Ⅱ A was 89.92% and RMSECV was 0.065. The results indicated the feasibility of determining tanshinone Ⅱ A in Radix Salviae Miltiorrhizae using near infrared reflectance spectroscopy coupled with HPLC. Conclusion The proposed method is fast and non-destructive， and provides a novel efficient and environmental friendly approach for the rapid determination of the active components in chinese herbal medicines.
[Key words] Radix Salviae Miltiorrhizae； HPLC； tanshinone Ⅱ A； Near-infrared spectroscopy coupled with liquid chromatography； Quality controls
丹参是一种常用的中药，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参应用历史比较悠久，味苦，性微寒，归心、肝经[1]。现代化学研究表明，丹参中主要成分为丹参酮类及丹酚酸类，其中丹参酮ⅡA是含量相对较高的代表性成分[2]。药效学研究证明丹参具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效。多用于月经不调，经闭痛经，癥瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心肌缺血，心绞痛等症状[3]。
中药饮片是中药材经过按中医药理论、中药炮制方法，经过加工炮制后的，可直接用于中医临床的中药[4-6]。中药饮片是临床处方药，又是中成药投药原料，但中药饮片质量缺乏快速检测及控制的方法。因此，建立中药饮片质量的科学评价体系，从不同的角度对中药饮片的质量进行评价是现在迫切需要解决的问题。近红外（NIR）光谱分析是近年来迅速发展和推广应用的一种快速、绿色、无损的分析技术，适用于中药饮片复杂样品的定性和定量分析[7-10]。近红外光谱分析技术已经广泛地应用于中药材、中药饮片和中成药的中药质量控制和真伪鉴别[11-15]。
本实验采用近红外漫反射光谱结合高效液相法测定不同来源丹参饮片中丹参酮ⅡA含量，同时运用偏最小二乘回归法建立丹参中丹参酮ⅡA含量测定的定量校正模型，两种方法的结合，共同实现丹参中药饮片生产过程中快速和准确的质量控制。
1 仪器与材料
Antaris傅立叶变换近红外光谱仪，配有积分球、样品旋转台、样品杯、光谱采集软件和TQ8.3.125分析软件（美国Thermo公司），Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），梅特勒XS-105电子分析天平（0.01 mg，METTLER TOLEDO，Switzerland），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），KQ-500DB型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TGL-16B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、MB45卤素水分测定仪（奥豪斯国际贸易（上海）有限公司），甲醇（色谱纯，Tedia company），丹参样品采于各产地，经浙江中医药大学中药饮片有限公司质检科张华安老师鉴定为为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取丹参酮ⅡA对照品10 mg，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2 供试品溶液的制备
取本品粉末（过三号筛）0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（75∶25）为流动相；检测波长为270 nm。理论板数按丹参酮ⅡA 峰计算不低于2000。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4 丹参中的丹参酮ⅡA含量的HPLC测定结果
按照《中国药典》2010年版一部中关于丹参中丹参酮ⅡA含量测定的各项要求进行测定[8]，丹参酮ⅡA对照品的HPLC色谱图，丹参样品的HPLC色谱见图1。由对照品和样品的色谱图对照可知，丹参酮ⅡA为样品色谱图中15 min左右的峰。每批样品平行测定2份，每份平行进样2次，外标法定量，丹参样品中丹参酮ⅡA的含量测定结果见表1。《中国药典》2010年版一部中规定丹参中丹参酮ⅡA含量不得少于0.2%，由表1中的结果可知所有丹参样品中丹参酮ⅡA含量均高于0.2%，表示各批次丹参中丹参酮ⅡA含量均符合《中国药典》2010年版一部。
A：对照品丹参酮ⅡA阴性；B：对照品丹参酮ⅡA；C：丹参饮片
图1 各溶液的HPLC色谱图
表1 HPLC法对丹参中丹参酮ⅡA的测定结果
2.5 近红外漫反射光谱测定
将丹参饮片样品在60℃干燥后粉碎，过100目筛，每份样品取约2 g，混合均匀后放入石英样品杯中，摊平，以内置背景作为参比，扣除参比，采集光谱图。采样方式：积分球漫反射；波数区间：12 000～4000 cm-1；分辨率8.0 cm-1；扫描次数32次；empty门衰减；增益为2；温度（25±2）℃，相对湿度45%～50%。每份样品扫描5次，求平均值作为样品的NIR光谱，结果见图2。
图2 丹参饮片的近红外光谱图
2.6 丹参近红外漫反射光谱法定量模型的建立
建模运用了近红外的漫反射原理，采用偏最小二乘法（PLS）建立定量校正模型，以校正集样品的交叉验证均方差（RMSECV）为指标优化建模参数，模型对未知样品的预测结果用模型标准差（SEE）来考核。应用Thermo公司的TQ8.3.125定量分析软件进行丹参样品的近红外漫反射光谱数据处理，选择12 000～4000 cm-1测，其结果见表2。从预测结果来看样品近红外光谱与丹参中丹参酮ⅡA之间存在一定的相关性，因此将该方法用于丹参中丹参酮ⅡA的测定基本可行。用校正样品集进行交叉验证，最终15个丹参样品中选取11个建立校正模型。结果显示，选择最佳维数：5，交叉验证均方差（RMSECV）=0.065，决定系数（r）=89.92%。
表2 校正集丹参中丹参酮ⅡA的预测结果
3 讨论
本文利用近红外漫反射光谱与HPLC分析技术相结合，采用偏最小二乘法建立快速测定不同批次丹参饮片中丹参酮ⅡA含量的分析方法。通过内部和外部验证，结果显示定量模型的预测值与化学值的相关系数为89%以上，研究结果证明该法操作简单，测定速度快，效率高，无污染，费用低，无需复杂的前处理及化学反应过程，可以直接对大量未知样品进行测定，为快速鉴定丹参饮片及质量控制提供了新的手段。在今后的研究中将进一步利用红外光谱技术，建立中药饮片的红外指纹图谱数据库，从整体上控制饮片的质量。对其生品和炮制品进行整体分析，总结分析中药饮片的宏观指纹特征，建立其快速鉴别方法。随着化学计量学和相应软件的不断开发，可以预计近红外光谱在中药饮片质量控制领域会有更广阔的应用前景，将会对中药的规范化和现代化进程起到巨大的推动作用。同时也是保证广大人民群众用药安全和实现中医药现代化亟待解决的关键问题。
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（收稿日期：2013-11-19 本文编辑：卫 轲）
