对照品溶液配制
准确称取绿原酸标准品25mg，加入50%甲醇溶液使之充分溶解，定容至10mL，摇匀，制得250μg/mL的标准储备溶液，于5℃冰箱中保存。对绿原酸标准品溶液进行倍比稀释操作，配制成1，5，20，30，40，60，80，100μg/mL。8个浓度梯度的系列绿原酸对照品溶液，体积均为1mL。
1.3.2 供试品溶液配制
称取试样金银花5份，分别浸泡于不同比例的甲醇-水溶液10mL中，见表1：
常温下浸泡15h后，在旋涡振荡器中混匀，进行超声萃取20min，然后离心2min（6000 r/min），吸取上清液1mL过0.22μm水系微孔滤膜过滤后供UPLC-MS进行测定。
2 实验结果与讨论
2.1 色谱条件优化
实验探索阶段，使用了UPLC-UV法对金银花中绿原酸进行定量分析。然而，在金银花中，绿原酸的异构体较多，对准确测量绿原酸单体的含量有很大的影响，色谱峰无法完全分开的同时，HPLC的灵敏度和检测时间不能满足高通量分析的要求。另外考察了不同的流动相组成以及比例对金银花中绿原酸定量分析产生的影响，并考察了流速对定量分析产生的影响。结果显示：甲醇：甲酸水溶液（0.4%）（50：50）时，绿原酸的峰值形状和响应均符合要求，分析时间较短（2min），最终确定为流动相，流速为0.3mL/min时检测效果最好。通过正、负离子2种扫描方式，发现绿原酸在正离子模式下响应较好。因此，实验最后选择正离子检测的方法对金银花进行定量分析。如图2所示为CGA的TIC和EIC图，图3所示为CGA的质谱图。
2.2 绿原酸标准曲线绘制
分别吸取适量体积上8个系列对照品溶液，按已建立好的检测条件进行检测，以绿原酸的峰面积（Y）为纵坐标，以绿原酸的浓度（X）为横坐标，进行线性回归。确定绿原酸的标准曲线为y=49156x+260783，R2=0.9969，线性范围为5～80μg·mL-1。
2.3 绿原酸的提取条件优选
本实验考察了不同比例甲醇-水溶液作为提取溶剂，对金银花中绿原酸的含量测定的影响。结果表明：80%甲醇作为提取溶剂时金银花中的绿原酸溶出效果最佳，超声回流时间为20min。在实验探索阶段，未考虑到料液比，在料液比为1：10时，金银花中的绿原酸提取不完全，金银花中的化学成分无法完全溶出。因此料液比改为1：1000，实验结果中金银花的绿原酸含量符合药典标准，约为4.5%（45.9g/kg），大于1.5%。
将表1所示A～E五个供试液按预设定的色谱条件进行分离，按所设定的质谱条件进行检测，检测结果见下图4：
2.4 重复性试验
分别称取试样金银花5份，浸泡于甲醇：水80%的溶液10mL中，浸泡15h后，在旋涡振荡器中混匀，进行超声萃取20min，然后离心2min（6000r/min），吸取上清液1mL过0.22μm水系微孔滤膜过滤后经UPLC-MS进行测定，测定结果如下：
结果表明，绿原酸的平均含量为24.2g/kg，RSD为2.4%，符合相关重复性要求。
2.5 精密度和准确度分析
精密吸取序号为已知含量的金银花试样提取液0.5μL共五份，其中金银花中绿原酸含量分布范围18.7～31.2g/kg，分别加入绿原酸对照品溶液（62.2μL/mL）适量，按照预定的检测条件进行定量分析，计算加样回收率。结果见下表：
在试验条件下，以金银花样品提取液加标低、中和高3种浓度即4.60、8.57和16.4μg/mL分别连续测定5次，计算加标回收率，并以相对标准偏差（RSD）计算精密度。3种浓度加标回收率为99.8%～104.9%，RSD为1.9%～3.5%（n=5），表明该方法准确度与精密度良好：
3 結论
我们建立了一种超声提取金银花中绿原酸的方法，并采用UPLC-MS方法测定了金银花中绿原酸的含量。结果表明：样品经80%甲醇浸泡15h，超声提取20min，提取效率最好。采用UPLC-MS方法检测时，绿原酸检测限为0.05mg/kg，在5-80μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，该方法平均回收率为103.9%，相对标准偏差RSD不大于3.5。综上，本法简便、快速，准确度高，可用于金银花中绿原酸的定性定量检测。
参考文献：
[1]张永清，程炳嵩.我国金银花资源及其利用[J].中国野生植物，1991（03）：10-14.
[2]崔春雨.金银花中绿原酸的高效分离方法研究[D].南宁：广西大学，2012.
[3]国家药典委员会，中华人民共和国药典（第一部）[M].北京：化学工业出版社，2000.（下转第256页）
（上接第254页）
[4]吴江涛.绿原酸的生物活性及其应用[J].现代农业科技，2009（19）：349-350.
[5]孙阳，黄和，胡燚.绿原酸提取纯化方法的研究进展[J].化学试剂，2017，39（03）：257-262.
[6]赵佳鑫，王浩兵，邓力，李垚村，尹春萍，马元春.金银花提取物制备工艺优化及其质量标准初探[J].中国药师，2019，22（03）：461-465.
[7]Fu J， Yang L， Khan MA， et al. Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb. By using improved PAPD analysis[J].Mol Biol Rep，2013，40（10）：5993-5999.
[8]徐跃成.金银花中绿原酸的提取分离及其抑菌作用研究[D].重庆：重庆大学，2008.
[9]李杰，王学廷，吴银萍，王利辉.金银花中绿原酸提取方法的研究进展[J].安徽农业科学，2014，42（16）：4969-4970+4973.
[10]刘军海，裘爱泳.绿原酸及其提取纯化和应用前景[J].粮食与油脂，2003（09）：44-46.
[11]辜俊鑫，辜瑜，张学霞，魏晓玲，王成琼，曾容，谯春燕.高效液相色谱法测定枇杷叶膏中绿原酸含量[J].中国药业，2019，28（05）：43-45.
[12]Wagner L， Kall C， Fridjonsson E O， May E F， Stanwix P L， Graham B F， Carroll M R J， johns M L. Quantitative produced water analysis using mobile 1H NMR[J]. Measurement Science and Technology，2016，27（10）：105501.
