纤支镜检查联合BALF细胞p53突变的检测对肺癌的诊断价值

时间:2022-03-05 10:14:49 公文范文 浏览次数:

[摘要] 目的 探讨纤支镜检查联合支气管肺泡灌洗液中细胞p53突变检测对肺癌的诊断价值。方法 对可疑肺癌患者行纤支镜检查,并以聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法检测BALF细胞p53的第5、6、7、8外显子突变情况。 结果 在最终确诊的68例肺癌患者中,纤支镜检查诊断肺癌49例, p53突变检测发现37例,纤支镜检查与检测BALF中细胞p53突变联合的方法共同检出61例肺癌患者,阳性率高达89.7%,较单独纤支镜检查差异有高度统计学意义(P < 0.01)。结论 PCR-SSCP法检测BALF中p53突变可弥补纤支镜检查的不足,有助提高肺癌的诊断率。

[关键词] 肺癌;纤支镜检查;支气管肺泡灌洗液;p53基因;基因突变

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)03-0062-03

肺癌是对人类健康和生命威胁最严重和最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率逐年上升。世界范围内其发病率居各肿瘤之首[1]。但对肺癌患者的诊断和鉴别却是临床工作的难点。目前纤支镜在临床应用非常广泛,因其能进行活检和细胞学检查,对病变性质的判断有着重要意义,但对肺癌诊断的灵敏性取决于肿块的位置、大小、形态等因素,对直径小于2 cm的周围型病变诊断率则较低[2]。现代分子生物学研究认为,肿瘤的发生与基因变化有关,癌基因的活化和抑癌基因的突变是其发生发展的关键环节。p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因之一,本实验通过检测支气管肺泡灌洗液中细胞p53突变,旨在弥补纤支镜在肺癌诊断中的不足,寻求敏感的肺癌诊断新方法。

1 资料与方法

1.1 一般材料

选取2006年1月~2011年12月临床上可疑的肺癌患者82例,男48例,女34例,年龄23~72岁,平均(58.3±8.6)岁,均具有完整的临床资料,所有病例均经病理学或细胞学确诊,其中肺癌患者68例,肺结核、炎性假瘤等良性病变14例。肺癌组中鳞癌38例,腺癌21例,其他9例;根据2002年UICC制订的标准行TNM分期,Ⅰ~Ⅱ期41例,Ⅲ~Ⅳ期27例;分化程度为高、中分化者36例,低、未分化者32例。所取病例均排除其他系统肿瘤以及风湿病、糖尿病等疾病。

1.2 纤维支气管镜检查

采用日本Olympus纤维支气管镜,按常规进行支气管镜检查。2%的利多卡因局部麻醉后,根据影像学提供的病变位置,将纤维支气管镜经鼻腔插入肺部支气管病变处,对病变肺段进行支气管肺泡灌洗,经活检孔快速注入预热为37 ℃的无菌生理盐水,负压吸引回收,共灌洗两次,回收液过滤后3000 r/min离心10 min,弃上清留细胞沉淀-80 ℃保存。随后对病变部位进行活检和刷片,标本分别送病检和细胞学检查。

1.3 DNA提取

采用常规蛋白酶K消化,酚-氯仿-异戊醇抽提法提取DNA,无水乙醇沉淀,70%乙醇洗涤,pH8.0的Tris-EDTA溶液50 μL溶解。以紫外分光光度法测定DNA的纯度及浓度,A260/A280比值在1.8~2.0之间可用于下一步实验。若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高,应用氯仿再次抽提纯化。提取的DNA产物分装保存于-20℃冰箱。

1.4 PCR扩增

选择常发生突变的研究热点p53的5~8外显子[3],引物设计参考文献[4,5],序列如下,第5外显子:5"-TTC CTC TTC CTG CAG TAC TC和5"-CAG CTG CTC ACC ATC GCT AT;第6外显子:5"-ACA GGG CTG GTT GCC CAG GGT和5"-AGT TGC AAA CCA GAC CTC AGG CG;第7外显子:5"-TCC TAG GTT GGC TCT GAC TGT和5"-AGT GGC CCT GAC CTG GAG TCT;第8外显子:5"-GGG ACA GGT AGG ACC TGA TTT CCT T和5"-ATC TGA AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系:10×TaqDNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+) 5 μL,10 mM dNTP 1 μL,25 mM MgCl2 4 μL,上、下游引物(10 mM)各1 μL ,Taq DNA聚合酶1 U,模板DNA 0.2~0.3 μg,补ddH2O至50 μL。反应条件:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,54℃~62℃退火40 s,72℃延伸60 s,共36个循环,72℃再延伸10 min。反应完成后,取5μL产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增情况,如出现清晰的目的条带,且无杂带的PCR产物,可行SSCP分析。

1.5 SSCP分析

将PCR扩增产物与变性上样液(98%甲酰胺,10 mM EDTA,0.03%二甲苯青,0.05%溴酚蓝)1︰2混合,98℃变性10 min,冰浴骤冷5 min,快速上样于8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),5 V/cm垂直电泳,电泳缓冲液为1×TBE,电泳4~6 h。取下凝胶进行银染,于暗室中硝酸银染色30 min,3%碳酸钠显色,至凝胶出现褐色条带,背景为透明的淡黄色时弃去染色液,10%冰醋酸终止显色,于凝胶成像系统拍照并保存。用对照组扩增的SSCP带型作为阴性对照,如出现单链DNA条带数目的增加﹑减少或位置的相对移位则判断为有突变发生。

1.6 统计学分析

本组所得数据行χ2检验,数据统计在SPSS 13.0软件上进行,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR-SSCP检测结果

p53各外显子均扩增出了相应的PCR产物(图1)。SSCP分析发现,对照组14例均未发现突变,肺癌组68例中有37例发生突变,突变发生率为54.4%(图2)。其中男性21例(21/40),女生16例(16/28),两者比较差异无统计学意义(χ2=0.143, P > 0.05)。按病理分类,鳞癌26例(68.4%,26/38),腺癌7例(33.3%,7/21),其他4例(44.4%,4/9),鳞癌与腺癌中突变比较差异有统计学意义(χ2=6.756,P < 0.01)。按TNM分期,Ⅰ~Ⅱ期突变20例(48.8%,20/41),Ⅲ~Ⅳ期突变17例(63.0%,17/27),两者比较差异无统计学意义(χ2=1.320,P > 0.05)。按分化程度,高、中分化者突变14例(38.9%,14/36),低、未分化者突变23例(71.9%,23/32),两者比较差异有统计学意义(χ2=7.431,P < 0.01)(表1)。检出各外显子突变情况:第5外显子7例,第6外显子10例,第7外显子8例,第8外显子12例。

2.2 纤支镜检查结果和联合检测的评价

本组病例中,通过活检经组织病理学诊断肺癌46例,通过刷检经细胞病理学诊断肺癌40例。活检和刷检共诊断肺癌49例,通过刷检细胞学检查使纤支镜对肺癌的诊断率从67.1%提高到72.1%。68例肺癌患者中,通过纤支镜活检和细胞学检查共发现49例,检测BALF中p53突变发现37例。37例p53突变的患者有12例在纤支镜活检和细胞学检查中无特殊发现,而最终通过手术病理证实为肺癌。二者联合共诊断检出肺癌61例,阳性率为89.7%,与单独纤支镜检查(72.1%)的差异有高度统计学意义(χ2=6.848,P < 0.01)。

3 讨论

纤支镜检查在临床应用广泛,是肺癌诊断的重要手段[6,7]。通过对病变部位支气管钳夹活检、刷检、经支气管针吸活检等,纤支镜可对大部分病例进行有效诊断。然而,钳夹活检、刷检对直径大于2 cm且外向型生长的肿块有较高的诊断率,但仍有部分肺癌,特别是周围型肺癌诊断较为困难[2]。另外,在纤支镜检查时,选择怎样的联合策略一直以来倍受争议[8]。本实验通过在纤支镜检查时,利用活检、细胞学联合敏感基因突变的方法,探索其在肺癌诊断中的应用价值。

既往研究证实,基因突变存在于人体的多种体液细胞中,对这些体液细胞中的基因学检测有助于肿瘤的诊断。Tobi等[9]通过结肠洗涤液中K-ras基因突变情况用于结肠肿瘤的诊断和鉴别,支气管肺泡灌洗液在肺癌诊断中的价值已有大量的研究报道[10, 11]。Oshita等[12]研究发现,检测支气管肺泡灌洗液中K-ras突变对肺癌诊断敏感性可高达75% 。因此,检测BALF中的敏感基因突变可能是一个有效的肺癌辅助诊断方法,是探索肺癌诊断新方法的努力方向。

p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因之一,在人类一半以上的恶性肿瘤中发现有p53基因的异常,约50%非小细胞肺癌和70%小细胞肺癌患者存在有p53突变[13,14]。本研究通过对p53突变的检测,发现能弥补纤支镜检查的不足,二者联合对肺癌诊断率高达89.7%,较单独纤支镜检查差异有高度统计学意义(P < 0.01)。本组实验数据显示,性别并不是p53突变发生的危险因素。p53突变在不同的TNM分期中也无统计学意义,提示p53突变可能是肺癌发生中的早期事件。本研究还发现,p53突变在鳞癌和腺癌患者之间,以及不同分化程度的组别之间差异有高度统计学意义(P < 0.01),因而检测BALF中p53突变对肺癌的临床病理分型和预后的判定可能具有一定的指导意义。

本研究不足在于,不同位置、大小和形态的肿块纤支镜检查阳性率有所不同[2],因病例数有限而未对不同类型肿块分别评价联合检测的价值。但是鉴于任何肿块通过纤维支气管镜检查灵敏度有限的前提下,检测BALF细胞中p53突变可弥补其不足并提高阳性率。同时,纤维支气管镜活检存在一定的风险,有些患者不能接受或存在某些禁忌,如凝血功能障碍或血压过高等安全问题而限制其应用。此时,检测BALF中p53突变不失为一种很好的诊断方式,因其安全性高、并发症少更能广泛应用于临床。

综上所述,检测BALF中p53突变可弥补纤支镜检查的不足,二者联合有助提高对肺癌的诊断率,对肺癌的诊断有着重要意义,并对临床病理分型和预后的判定可能具有一定的指导价值。由于肿瘤发生的分子生物学基础是基因的异常,基因的改变常先于临床症状的出现,检测BALF中p53突变甚至还可以达到对肺癌早期诊断的效果。

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(收稿日期:2012-11-26)

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